Utilisation de l’optogénétique pour inverser la neuroplasticité et inhiber la recherche de cocaïne chez le rat

Ce protocole est important parce qu’il utilise de nouvelles avancées dans les techniques optogénétiques et un modèle préclinique de toxicomanie pour inverser la plasticité dans les circuits neuronaux qui sont responsables de la promotion de la rechute. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une manipulation spécifique du circuit de l’activité synaptique chez un animal éveillé, ce qui a des effets inhibiteurs durables sur le comportement futur de recherche de cocaïne motivé par des signaux. Cette méthode pourrait être utilisée dans de nombreux autres systèmes et circuits pour manipuler spécifiquement la neuroplasticité comportementale pertinente.

Commencez à vous préparer à la chirurgie en connectant une canule d’injection en acier inoxydable de calibre 26 à une seringue Hamilton remplie d’un microlitre de solution concentrée d’AAV. Après avoir anesthésié l’animal, raser la zone chirurgicale et lubrifier les yeux pour éviter le dessèchement comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, injectez au rat un volume de poids corporel de carprofène analgésique par voie sous-cutanée à travers la peau du haut du dos et injectez cinq millilitres de solution de Ringer lactée par voie sous-cutanée à travers la peau du bas du dos.

Effectuez ensuite l’implantation du cathéter intraveineux. Immédiatement après l’implantation du cathéter, fixez le rat dans un cadre stéréotaxique pour effectuer des injections virales adéno-associées. Injectez un bolus de lidocaïne par voie sous-cutanée à travers la peau au-dessus du crâne afin d’anesthésier localement la zone, puis faites une incision de 0,5 millimètre de l’avant à l’arrière du crâne.

Enlevez le tissu sus-jacent pour exposer la surface du crâne. Nivelez la tête du rat le long de l’axe postérieur antérieur et ne coordonnez pas stéréotaxique au bregma, puis utilisez un outil dremel équipé d’un petit foret pour percer trois petits trous dans le crâne et montez des vis en acier inoxydable en place avec un tournevis. Pour l’injection d’AAV, percez des trous bilatéraux basés sur les coordonnées de l’Atlas du cerveau de rat pour le noyau géniculé médian ou MGN.

Les coordonnées utilisées par rapport au bregma sont moins 5,4 millimètres sur l’axe postérieur antérieur, plus trois millimètres sur l’axe latéral médian et moins 6,6 millimètres sur l’axe ventral dorsal. Abaisser lentement la canule d’injection à environ quatre millimètres par minute, jusqu’à ce que les canules soient correctement positionnées dans le MGN, et injecter une solution concentrée d’AAV à un débit de 0,1 microlitre par minute. Une fois les perfusions terminées, laissez la canule d’injection en place pendant cinq minutes pour permettre la diffusion du virus loin de la canule, puis retirez lentement la canule du cerveau.

Ensuite, procéder à l’implantation de fibres optiques ciblant les terminaux latéraux de l’amygdale du noyau géniculé médial. Utilisez un outil dremel pour percer des trous bilatéraux au-dessus de l’amygdale latérale, aux coordonnées expliquées dans le manuscrit. Utilisez des pinces pour saisir la virole de l’implant de fibre optique et fixez la virole aux adaptateurs stéréotaxiques en place.

Abaisser lentement les fibres à un rythme de deux millimètres par minute jusqu’à ce que l’extrémité de la fibre se trouve dans la partie dorsale du LA. Fixez les viroles à la peau, d’abord à l’aide d’une fine couche d’adhésif instantané Loctite, puis de ciment dentaire. Une fois que le ciment dentaire a suffisamment séché, couvrez les viroles avec des manchons de virole et des housses anti-poussière. Après les interventions chirurgicales, logez le rat individuellement et rincez quotidiennement les cathéters avec une solution saline contenant cinq milligrammes par millilitre de gentamicine et 30 unités USP par millilitre d’héparine.

24 heures avant le début des expériences comportementales, la nourriture limite les rats à 90% de leur poids alimentaire libre. Placez le rat dans une chambre d’opération pour subir des séances d’entraînement quotidiennes d’une heure pour l’auto-administration de deux milligrammes par millilitre de cocaïne, selon un programme fixe de renforcement. Dans la chambre, laissez le rat appuyer sur levier.

Une pression sur le levier actif désigné entraîne une perfusion de cocaïne à raison d’une dose d’un milligramme par kilogramme et une présentation de dix secondes d’un signal lumineux et sonore composé. Une pression sur le levier inactif désigné n’a pas d’effets programmés. Poursuivre les expériences d’auto-administration pendant au moins 10 jours, jusqu’à ce que le rat obtienne au moins huit perfusions par jour pendant trois jours consécutifs.

Le fait de ne pas atteindre les critères d’acquisition au jour 20 entraîne l’exclusion de l’étude. Une fois les critères d’acquisition remplis avec succès, soumettre le rat à des séances d’extinction instrumentale d’une heure pendant six à 10 jours en permettant aux rats d’appuyer librement dans des chambres opérationnelles. Continuez l’extinction instrumentale quotidiennement jusqu’à ce qu’une moyenne de 25 pressions à levier maximum sur deux jours consécutifs se produise.

Pour l’induction optogénétique de la dépression à long terme ou LTD, connectez les câbles de raccordement à une diode laser bleue de 473 nanomètres via un joint rotatif suspendu au-dessus d’une cage de logement de rongeur propre et standard. Allumez le laser conformément aux instructions d’utilisation et connectez le laser à un générateur d’impulsions. Ajustez les réglages pour donner au rat les 900 impulsions de lumière à deux microsecondes, à un hertz.

Mesurez le flux lumineux à travers le cordon de raccordement à l’aide d’un capteur de lumière et ajustez l’intensité du laser de sorte que le flux lumineux à travers le câble de raccordement soit d’environ cinq à sept milliwatts. Placez le rat dans la cage propre du logement et retirez les couvercles anti-poussière et les manchons de virole exposant les viroles. Ensuite, connectez les cordons de raccordement bilatéralement à chaque virole.

S’ils sont installés correctement, les rongeurs pourront se déplacer librement dans la cage pendant la stimulation optogénétique. Après avoir permis au rat d’explorer l’environnement pendant trois minutes, allumez le générateur d’impulsions pour initier une stimulation optogénétique. Après une induction de dépression à long terme, laissez le rat rester dans la cage pendant trois minutes, avant de le remettre dans la cage domestique.

24 heures après la stimulation optogénétique in vivo, replacez le rat dans les chambres de conditionnement opérantes pour subir une séance de réintégration standard d’une heure afin d’évaluer le comportement de recherche de cocaïne. Une pression sur le levier actif donne une présentation de dix secondes du signal lumineux et tonal. Au moins une semaine après le premier test, effectuer un deuxième test de réintégration pour déterminer si l’induction optogénétique de la LTD entraîne une suppression à long terme de la recherche de cocaïne.

Dans l’analyse représentative, l’acquisition et l’extinction de l’auto-administration de cocaïne sont montrées. Les perfusions de cocaïne et les réponses actives par levier ont augmenté tout au long de l’acquisition, avec peu de réponses de levier inactives. Au cours de l’auto-administration de cocaïne, le nombre de réponses actives a augmenté progressivement au cours de chaque jour d’acquisition avant de se stabiliser au cours de la deuxième semaine.

Le premier jour de l’extinction, et une augmentation initiale du levier de pression a été observée, suivie d’une diminution de la réponse sur les deux leviers. Après l’extinction instrumentale, la réintroduction des signaux a rétabli la recherche de cocaïne, représentée par une augmentation du nombre de réponses actives par levier. Optical LTD a entraîné une réduction significative des presses à levier actives par rapport aux commandes.

Sept jours plus tard, les rats ont été testés à nouveau. Les animaux qui ont déjà subi MGN-LA LTD avaient considérablement réduit le pressage actif du levier par rapport aux témoins, révélant que la LTD optique produisait une diminution à long terme de la recherche de cocaïne. Des enregistrements électrophysiologiques ex vivo ont montré une diminution de l’amplitude du courant postsynaptique excitateur évoqué optiquement dans les neurones LA, suite à une LTD optique.

De plus, la pente ascendante des potentiels postsynaptiques excitateurs a été réduite par stimulation optique ex vivo dans les neurones, chez les animaux qui ont eu une stimulation simulée, mais pas dans les neurones des animaux qui avaient une LTD optique in vivo. La pose d’implants de fibres optiques et l’expression virale ont été vérifiées histologiquement dans l’amygdale latérale et la MGN. Pour réussir à réduire le comportement de recherche de cocaïne, il est essentiel d’obtenir un rendement lumineux approprié à travers les implants de fibres optiques et d’utiliser une stimulation soutenue à basse fréquence pour favoriser la dépression à long terme.

Après cette procédure, des techniques d’enregistrement neuronal pourraient être utilisées pour déterminer les changements dans l’activité neuronale, et d’autres tests comportementaux de recherche de cocaïne ou d’autres comportements appris pourraient être effectués.