Name: Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée 1-13 C pyruvate et 13C/31P (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Apprenez à étudier le métabolisme cardiaque en temps réel dans le cœur de souris perfusé isolé grâce à la spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13C]pyruvate et 31P.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce projet a reçu un financement de la Fondation israélienne pour la science en vertu de la convention de subvention n° 1379/18; la bourse Jabotinsky du ministère israélien de la Science et de la Technologie pour les sciences appliquées et les sciences de l’ingénieur pour les doctorants directs n ° 3-15892 pour D.S.; et le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 858149 (AlternativesToGd).

Il n’y a pas de divulgations.

Nous démontrons une configuration expérimentale conçue pour étudier le métabolisme hyperpolarisé du [1-13C]pyruvate, l’énergétique tissulaire et le pH dans un modèle cardiaque de souris isolé.
Les étapes critiques du protocole sont les suivantes : 1) s’assurer que le pH du tampon est de 7,4; 2) s’assurer que tous les composants du tampon sont inclus; 3) éviter la coagulation du sang dans les vaisseaux cardiaques par injections d’héparine; 4) éviter les dommages ischémiques au cœur e...

Les altérations du métabolisme cardiaque sont associées à une variété de cardiomyopathies et constituent souvent la base des mécanismes physiopathologiques sous-jacents1. Cependant, il existe de nombreux obstacles à l’étude du métabolisme dans les tissus vivants, car la plupart des tests biochimiques nécessitent l’homogénéisation de la lyse tissulaire et cellulaire et / ou le traçage radioactif. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouveaux outils pour étudier le métabolisme myocardique dans les tissus vivants. La résonance magnétique (RM) de substrats hyperpolarisés marqués au 13C permet de mesurer en temps réel le métabolisme dans les tissus vivants2, sans utiliser de rayonnement ionisant, en augmentant le rapport signal sur bruit (SNR) MR du ou des sites marqués de plusieurs ordres de grandeur3. Ici, nous décrivons une configuration expérimentale, une approche d’acquisition et une approche analytique pour étudier le métabolisme rapide dans le cœur isolé de souris et, en parallèle, présentons des indicateurs de l’énergétique générale des tissus et de l’acidité. Le pH cardiaque est un indicateur précieux, car l’équilibre acido-basique est perturbé dans les premiers stades des maladies cardiaques et des affections telles que l’ischémie myocardique, l’hypertrophie inadaptée et l’insuffisance cardiaque6.
La production hyperpolarisée de [1-13 C]lactate et de [13 C]bicarbonate à partir de [1-13C]pyruvate hyperpolarisé aide à déterminer les taux de production de lactate déshydrogénase (LDH) et de pyruvate déshydrogénase (PDH). La plupart des études précédentes réalisées à l’aide de substrats hyperpolarisés dans le cœur isolé de rongeurs ont soit utilisé des modèles cinétiques complexes pour dériver l’activité enzymatique de la LDH et de la PDH, soit rapporté les rapports d’intensité du signal du produit hyperpolarisé sur un substrat sans calculer les taux d’activité enzymatique réels 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Ici, nous avons utilisé l’approche d’excitation saturante sélective du produit 15, qui permet de surveiller l’activité enzymatique de manière sans modèle15,16. De cette façon, les taux enzymatiques absolus (c’est-à-dire le nombre de moles de produit produites par unité de temps) ont été déterminés. 31 La spectroscopie P a été utilisée pour observer les signaux du phosphate inorganique (Pi), de la phosphocréatine (PCr) et de l’adénosine triphosphate (ATP). Une analyse multiparamétrique a été utilisée pour caractériser la distribution du pH du cœur, comme le démontre le déplacement chimique hétérogène du signal Pi du tissu.
Le cœur de souris rétrofusé (cœur de Langendorff)17,18,19 est un modèle ex vivo pour le cœur battant intact. Dans ce modèle, la viabilité cardiaque et le pH sont préservés pendant au moins 80 minutes20, et il a montré un potentiel de récupération après une lésion ischémique prolongée21,22. Néanmoins, une variabilité involontaire pendant la microchirurgie peut entraîner une variabilité de la viabilité tissulaire entre les cœurs. Des études antérieures ont fait état de la détérioration de ce cœur au fil du temps19; Par exemple, une réduction de la fonction contractile de 5% à 10% par heure a été observée18. Il a déjà été démontré que le signal de l’adénosine triphosphate (ATP) rapportait l’état énergétique et la viabilité du myocarde23. Ici, nous avons noté que le cœur perfusé peut parfois présenter une variabilité involontaire des niveaux de viabilité, comme le démontre la teneur en ATP, malgré le fait que nous avions une perfusion et un apport en oxygène ininterrompus. Nous démontrons ici que la normalisation des taux de LDH et de PDH à la teneur en ATP du cœur réduit la variabilité inter-cardiaque de ces taux.
Dans le protocole suivant, nous décrivons l’intervention chirurgicale utilisée pour la canulation cardiaque, l’isolement et la perfusion consécutive dans le spectromètre RMN. Il convient de noter que d’autres approches chirurgicales visant à isoler et à perfuser le cœur de souris ont été décrites avant24,25.
Les méthodologies utilisées pour acquérir des données relatives aux taux enzymatiques dans le cœur battant (en utilisant la spectroscopie 13 C et le [1-13C]pyruvate hyperpolarisé) et la viabilité et l’acidité du cœur (en utilisant la spectroscopie RMN 31P) sont également décrites. Enfin, les méthodologies analytiques pour déterminer les activités enzymatiques métaboliques et la viabilité et l’acidité des tissus sont expliquées.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3,35 T, dissolution-DNP hyperpolariseur RM</td></tr><tr><td>spectromètre&nbsp ;</td>Cube RMN <td>RS2D</td><td></td><td>, 5,8 T, équipé d’une sonde à large bande de 10 mm</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique&nbsp ;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de température</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>RMN sonde de température compatible</td></tr><tr><td>Somnosuite système d’anesthésie à faible débit</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, tubes, tubes de suture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum en silicone durci</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 I.D. 3,1 mm& nbsp ;</td></tr><tr><td>Lignes minces de polyéther éther cétone (PEEK)</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040"</td></tr><tr><td>Cathéter intraveineux&nbsp ;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Suture en soie</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Diamètre du fil de 3-0</td></tr><tr><td>Chemicals and pharmaceuticals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]acide pyruvique</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS : 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS : 50-99-77</td></tr><tr><td>Héparine sodique</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique 37 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS : 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insuline aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate</td> <td>de magnésiumSigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS : 7487-88-9</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS : 7447-40-7</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS : 7778-77-0</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Groupe</td><td></td> Gadot <td>CAS : 144-55-8</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS : 7647-14-5</td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS : 1310-73-2</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS : 7558-79-4</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique dihydraté</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS : 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (qualité biotechnologie)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS : 77-86-1</td></tr><tr><td>Radical trityle OX063</td><td>GE Healthcare AS NC100136</td><td></td><td>OX063</td></tr><tr><td>Étalons <>RMN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C Échantillon étalon</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40 % p-dioxane dans benzène-D6</td></tr><tr><td>31P Échantillon standard</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>105 mM d’ATP et 120 mM d’acide phénylphosphonique dans D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Recherche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie rmn hyperpolarisée [1-13 c]pyruvate et 13c/31p

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Le métabolisme est la base de processus importants dans la vie cellulaire. La caractérisation du fonctionnement des réseaux métaboliques dans les tissus vivants fournit des informations cruciales pour comprendre le mécanisme des maladies et concevoir des traitements. Dans ce travail, nous décrivons les procédures et les méthodologies pour étudier l’activité métabolique dans les cellules dans un cœur de souris rétrofusé en temps réel. Le cœur a été isolé in situ, en conjonction avec un arrêt cardiaque pour minimiser l’ischémie myocardique et a été perfusé à l’intérieur d’un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN). Dans le spectromètre et sous perfusion continue, du [1-13 C]pyruvate hyperpolarisé a été administré au cœur, et les taux de production de [1-13 C]lactate et de [13C]bicarbonate hyperpolarisés subséquents ont servi à déterminer, en temps réel, les taux de production de lactate déshydrogénase et de pyruvate déshydrogénase. Cette activité métabolique du [1-13C]pyruvate hyperpolarisé a été quantifiée par spectroscopie RMN de manière libre en utilisant l’approche d’acquisition sélective d’excitations saturantes de produits. 31 La spectroscopie P a été appliquée entre les acquisitions hyperpolarisées pour surveiller l’énergétique cardiaque et le pH. Ce système est particulièrement utile pour étudier l’activité métabolique dans le cœur de souris sain et malade.

Les spectres 31P enregistrés à partir d’un cœur de souris perfusé avec du KHB et du tampon seul sont représentés à la figure 1A. Les signaux de α, β et γ-ATP, PCr et Pi ont été observés dans le cœur. Le signal Pi était composé de deux composantes principales: dans le champ supérieur (côté gauche du signal), le signal Pi était principalement dû au KHB à un pH de 7,4; dans le champ inférieur (côté droit du signal), le signal Pi était plus large et moins homogène en raison de l’envir...

Nous décrivons une configuration expérimentale pour administrer des métabolites hyperpolarisés marqués au 13C en mode de perfusion continue à un cœur de souris perfusé isolé. Une approche dédiée d’acquisition de 13C-RMN a permis de quantifier l’activité enzymatique métabolique en temps réel, et une analyse multiparamétrique 31P-RMN a permis de déterminer la teneur en ATP tissulaire et le pH.

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13 C]pyruvate et 13C/31P

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In cette vidéo, vous apprendrez à effectuer des études IRM hyperpolarisées du cœur de souris perfusé. David Shaul, étudiant en médecine / doctorat dans le laboratoire, vous guidera à travers les différentes techniques et procédures. Aujourd’hui, nous apprenons un protocole pour étudier le métabolisme hyperpolarisé du carbone-13 pyruvate, combiné à la spectroscopie RMN 31P.Le métabolisme du pyruvate se situe au carrefour du métabolisme aérobie et anaérobie. Et en tant que tel, il est d’une grande valeur pour étudier diverses conditions du cœur. Alors, commençons.Le cœur de souris est isolé et perfusé avec un tampon Krebs-Hensleit, à l’intérieur d’un tube RMN de 10 millimètres. Le cœur est ensuite inséré dans le spectromètre RMN. Là, un spectre 31P est enregistré pour observer l’énergétique cardiaque et le pH, en observant les résonances de l’adénosine triphosphate, de la phosphocréatine et du phosphate inorganique.Pendant ce temps, un échantillon de pyruvate marqué avec du carbone 13 en première position est hyperpolarisé. Et après la dissolution, il est injecté au cœur pour permettre de mesurer le lactate, les inorganiques et le pyruvate des activités organisées en temps réel. U

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration...

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR Spectroscopy

L'objectif est de surveiller l'état redox mitochondrial de coeurs isolés dans le contexte de la précharge physiologique et les pressions postcharge. Un modèle de travail biventriculaire coeur de lapin est présenté. Haute résolution spatio-temporelle imagerie par fluorescence de NADH est utilisée pour surveiller l'état mitochondriale redox de tissu épicardique.

NADH imagerie par fluorescence de biventriculaire isolé travail coeurs de lapin

Un fantôme dynamique à plusieurs compartiments est utilisé pour simuler une biologie d’intérêt pour des études métaboliques utilisant des agents de résonance magnétique hyperpolarisés.

Utilisation d&#39;un multi-compartiment dynamique unique Enzyme Phantom pour les études de hyperpolarisé Agents de résonance magnétique

Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

La polarisation nucléaire dynamique avec dissolution ultérieure de l’échantillon a permis d’étudier en temps réel le métabolisme dans les systèmes biologiques. Le [1-13-C]pyruvate hyperpolarisé a été utilisé pour étudier in vitro l’activité de la lactate déshydrogénase dans une lignée cellulaire de carcinome de la prostate.

hyperpolarisé 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Ici, nous introduisons une méthode pour l'utilisation d'un cathéter optique intra-ventriculaire dans les cœurs perfus pour effectuer la spectroscopie absorbante à travers la paroi cardiaque. Les données obtenues fournissent des informations solides sur la tension de l'oxygène tissulaire ainsi que l'utilisation du substrat et le potentiel membranaire simultanément avec des mesures de performance cardiaque dans cette préparation omniprésente.

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

Nous présentons un protocole pour mesurer la dépendance de champ magnétique du temps de relaxation spin-lattice de 13composés C-enrichis, hyperpolarisés au moyen de la polarisation nucléaire dynamique, utilisant la relaxométrie champ-cycle rapide. Plus précisément, nous l'avons démontré avec [1-13C]pyruvate, mais le protocole pourrait être étendu à d'autres substrats hyperpolarisés.

Mesurer la dépendance au champ magnétique de relaxation spin-lattice de l'hyperpolarisé [1-13C]pyruvate

Ce protocole intègre un système de bioréacteur sur mesure avec une spectroscopie RMN ¹³C hyperpolarisée pour mesurer le métabolisme des pyruvates en temps réel dans les cellules vivantes, améliorant ainsi la reproductibilité et la précision cinétique pour les études métaboliques et les applications de criblage de médicaments.

Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN 13C hyperpolarisée

Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l'image mouvement d'action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Le protocole suivant décrit le processus d'isolement, de ventilation et d'instrumenter les poumons de souris pour mesurer stable ou pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit des relations afin de quantifier les effets de la circulation sanguine, circulation de l'air, les changements des voies aériennes et sur les modifications vasculaires postcharge ventriculaire droite.

Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

Apprenez à étudier le métabolisme cardiaque en temps réel dans le cœur de souris perfusé isolé grâce à la spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13C]pyruvate et 31P.

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée 1-13 C pyruvate et 13C/31P (Vidéo) | JoVE Journal

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13 C]pyruvate et ¹³C/³¹P

Explorer plus de vidéos