Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire

Le protocole a été développé pour la production de variantes de huntingin pleine longueur à une échelle de faible milligramme. Il permet d’obtenir des protéines constantes de haute qualité essentielles pour les chercheurs MH. La démonstration de la procédure sera Michael Harris, un chercheur scientifique du laboratoire Curia.

Commencez par ajouter un gramme de polyéthylèneimine 25 K à un litre d’eau exempte d’endotoxines, et remuez bien. Ajuster le pH à 2,0 en utilisant de l’acide chlorhydrique 100 millimolaires et remuer jusqu’à ce que tout le polyéthylèneimine se dissolve. Ajustez ensuite le pH à 7,0 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires et passez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre.

Faites des aliquotes de la solution filtrée et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Propager les cellules HEK293 dans le milieu de croissance supplémenté en streptomycine pénicilline dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 90 RPM, 5% de dioxyde de carbone pendant 18 à 24 heures. Un jour avant la transfection, diluer les cellules à une densité d’environ 1,2 x 10 à la sixième cellule de puissance par millilitre dans deux litres de milieu de croissance dans un erlenmeyer de cinq litres et incuber pendant 18 à 24 heures.

À la fin de l’incubation, mesurer la densité et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules en suivant les instructions du fabricant. Après avoir calculé la quantité de polyéthylèneimine et de plasmide nécessaire à la transfection, diluer la polyéthylèneimine et le plasmide individuellement dans 100 millilitres de PBS et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, mélangez le plasmide dilué et la polyéthylèneimine en remuant doucement et incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.

Ajouter le mélange à la culture cellulaire et mélanger en remuant doucement. Maintenant, laissez les cellules se développer pendant 24 heures. Le lendemain, ajouter une solution de butyrate de sodium à une concentration finale d’agent antiagglomérant et antimousseux à deux millimolaires au rapport volumique de 1:1 000 à la culture et incuber les cellules dans l’incubateur humidifié pendant 48 heures.

Après avoir mesuré la viabilité et la densité cellulaires, récoltez les cellules par centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes et stockez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius avant la purification. Pour la purification anti-FLAG à l’aide de FPLC, emballer 12 à 25 millilitres de résine anti-FLAG sur une colonne vide à un débit de quatre millilitres par minute en utilisant le tampon A et ajuster la hauteur du piston pour supprimer l’espace entre l’extrémité du piston et le lit de résine. Ensuite, suspendez la pastille de cellule décongelée dans un tampon de lyse froide et passez la suspension de la cellule une fois à travers un homogénéisateur à cisaillement élevé à une pression de 1 000 livres par pouce carré.

À l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un rotor compatible à angle fixe, clarifier le lysat à 20 000 G pendant une heure. Programmez FPLC sous la fenêtre Méthode, chargez le lysat clarifié via la pompe à échantillon et lavez la colonne avec les volumes de colonne souhaités de tampon A, B, C, D et tampon d’élution comme décrit dans le manuscrit texte. Une fois l’exécution terminée, analysez 10 microlitres des fractions de pic à l’aide de SDS-PAGE.

Combinez les fractions de pic avec la pureté souhaitée et économisez environ 50 microlitres des éluats combinés pour une analyse plus approfondie SDS-PAGE. Commencez à équilibrer la colonne SEC à l’aide du FPLC et chargez l’éluat anti-FLAG via une superboucle de 50 millilitres. Après avoir exécuté la mémoire tampon SEC, laissez la séparation SEC se produire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Comparez le profil d’élution avec le profil d’élution HTT standard pour distinguer les pics monomères, dimères et oligomères d’ordre supérieur. Regrouper les fractions HTT monomères en fonction du profil d’élution de la colonne SEC et, si vous le souhaitez, regrouper séparément les fractions HTT oligomères et dimériques d’ordre supérieur. Concentrer la protéine HTT accumulée à l’aide d’un concentrateur centrifuge de 100 kilodaltons à quatre degrés Celsius.

Après calcul de la concentration en protéines, aliquote inférieure à 100 microlitres de la protéine HTT purifiée dans un tube microcentrifuge cryo-sûr. Congelez rapidement les aliquotes à l’aide d’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Effectuer toutes les analyses SEC-MALS à quatre degrés Celsius sur le système HPLC, couplé à un détecteur UV, un détecteur de diffusion de lumière multi-angle, un détecteur d’indice de réfraction différentiel, et utiliser 0,185 comme incrément d’indice de réfraction pour HTT.

Purgez la pompe et les détecteurs avec de l’eau filtrée de qualité CLHP et connectez la colonne UHPLC au système. Équilibrez la colonne avec de l’eau filtrée, puis un tampon SEC-MALS jusqu’à ce que tous les signaux du détecteur atteignent la ligne de base. Injecter deux microlitres de solution BSA à un débit de 0,3 millilitre par minute pendant 15 minutes par injection.

Inspectez la qualité des données, effectuez la normalisation, l’alignement des pics et la correction de l’élargissement de la bande en fonction du profil BSA, et créez un modèle pour les exemples HTT suivants. Décongeler rapidement un flacon de l’échantillon FL Q23-HTT dans un bain-marie à température ambiante à l’aide d’un flotteur. Filtrez le HTT à travers un filtre de rotation de 0,1 micromètre.

Injectez deux à quatre microlitres de l’échantillon HTT et faites fonctionner pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à un débit de 0,3 millilitre par minute. Analysez les données chromatographiques et de diffusion de la lumière à l’aide du logiciel d’accompagnement et générez un diagramme de Zimm pour déterminer la masse moléculaire moyenne en poids pour chaque pic. Dans la présente étude, en utilisant un procédé de colonne en deux étapes, plus de 95% de pureté a été obtenue pour HTT et le principal contaminant était le chaperon Hsp70, qui a été éliminé par un lavage intensif avec du chlorure de magnésium et de l’ATP pendant l’étape de purification d’affinité anti-FLAG La surexpression de FL HTT peut entraîner une fragmentation de la protéine, mais FL Q23-HTT produit par la méthode résolue comme une seule bande avec le poids moléculaire correct de 350 kilodaltons indique qu’il n’y a pas fragmentation.

L’analyse par transfert Western après la réaction des anticorps avec FL Q23-HTT a démontré que la protéine était isolée sans troncature détectable significative, car aucune bande supplémentaire liée aux fragments n’a été observée. La variance de longueur poly-Q FL HTT, Q23, Q48 et Q73 a réagi comme prévu dans le transfert Western, montrant un signal progressivement plus fort pour l’anticorps monoclonal dirigé poly-Q MW1, corrélé à l’augmentation de la longueur Q. Parmi les colonnes HPLC testées, la colonne SEC a montré une résolution suffisante entre le monomère HTT et le dimère, de sorte que les masses molaires pouvaient être distinguées.

Le FL HTT purifié de la SEC a montré plusieurs bandes correspondant aux états d’oligomérisation, ce qui pourrait être dû à la présence de plusieurs plaques hydrophobes qui contribuent à la formation d’oligomères d’ordre supérieur pendant la migration dans le gel. Le HTT purifié a montré trois bandes principales sur le PAGE natif bleu avec un poids moléculaire estimé à 643, 927 et 1 070 kilodaltons qui représentent probablement les espèces monomères, dimériques et trimères de HTT, respectivement. Une manipulation appropriée de la huntingtine purifiée est essentielle pour éviter de générer des oligomères de haut ordre dans les agrégats solubles.

Il est impératif que l’utilisateur final travaille rapidement pour distribuer l’échantillon dans des tubes pré-refroidis avant la congélation instantanée. Les tests de stabilité à long terme peuvent être effectués sur des échantillons stockés à des périodes prolongées à moins 80 degrés Celsius. Des analyses HPLC SEC-MALS répéteront confirmer s’il y a eu un changement dans la teneur en monomères de l’échantillon.