Name: Synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez la synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif. Ce protocole détaillé utilise la chromatographie sur couche mince et la chromatographie éclair pour purifier le composé.

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La recherche a été soutenue par la National Science Foundation sous le numéro de subvention 2009522. L’analyse RMN de la masarimycine a été soutenue par l’attribution d’un important programme d’instrumentation de recherche de la National Science Foundation sous le numéro de subvention 1919644. Toutes les opinions, constatations et conclusions, ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

1. Méthodes générales
REMARQUE: Tous les composés ont été achetés auprès de fournisseurs standard et utilisés sans autre purification.
<ol><li>Effectuer une chromatographie sur couche mince (TLC) sur une plaque d’aluminium prélaquée de gel de silice XG F254. Détecter les taches sous une lampe UV, par immersion dans la tache de p-anisaldéhyde, ou en exposant à la vapeurI2 .</li>
	<li>Enregistrez tous les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) sur un spectromètre de 400 MHz. REMARQUE : 1spectre H-RMN et 13spectres C-RMN ont été référencés aux pics de solvant résiduels. Les constantes de couplage sont données en [Hz] et les décalages chimiques en [ppm].</li>
	<li>Enregistrer les spectres de spectrométrie de masse par ionisation chimique de pression atmosphérique (APCI) de la masarimycine sur un spectromètre de masse compact équipé d’une sonde d’analyse des solides atmosphériques.</li>
</ol>2. Procédure générale de préparation de la masarimycine
REMARQUE: Effectuez les étapes ci-dessous dans une hotte aspirante.
<ol><li>Préparer une solution de 0,1 M dans le méthanol de chaque réactif : cyclohexylamine, cyclohexyl carboxaldéhyde, acide o-iodobenzoïque et isocyanure de cyclohexyle35. ATTENTION : La cyclohexylamine, l’isocyanure de cyclohexyle et le cyclohexylcarboxaldéhyde sont inflammables. Ils peuvent provoquer une corrosion cutanée et induire une toxicité buccale, cutanée, respiratoire ou reproductive. Gardez les composés à l’écart des flammes nues, des surfaces chaudes et des sources d’inflammation. Portez une protection appropriée de la peau et des yeux, travaillez dans un endroit bien ventilé et évitez l’inhalation de vapeurs ou de brouillard. Pour le stockage, gardez les bouteilles hermétiquement fermées et conservez-les dans un endroit frais et sec. Conserver le cyclohexyl carboxaldéhyde dans un dessiccateur sous atmosphère deN2 .</li>
	<li>Mélanger 5 mL de cyclohexylamine (solution de 0,1 M dans le méthanol) et 5 mL de cyclohexyl carboxaldéhyde (0,1 M dans le méthanol) dans une fiole à fond rond coiffé et remuer la solution à l’aide d’une barre magnétique sur une plaque chauffante pendant 30 min à 40 °C dans un bain de sable. Surveillez la température à l’aide d’un thermomètre placé à environ 1 cm sous la surface du sable.</li>
	<li>Après 30 min, ajouter 5 mL d’isocyanure de cyclohexyle (solution de 0,1 M dans du méthanol) à la solution de l’étape 2.2 et remuer pendant 20 min supplémentaires à 50 °C. Enfin, ajouter 5 mL d’acide o-iodobenzoïque (solution 0,1 M dans du méthanol) au mélange réactionnel et continuer à agiter à 55 °C pendant 3-5 h.</li>
	<li>Surveiller périodiquement la progression de la réaction par TLC environ toutes les heures après que le mélange réactionnel ci-dessus ait été agité pendant 3 h.</li>
	<li>Coupez une bande de 3 cm x 6 cm de plaque TLC à dos d’aluminium. À l’aide d’un crayon #2, tracez une ligne à environ 1 cm du bas. À l’aide d’un microcapillaire en verre, repérez environ 5 μL du mélange réactionnel sur la plaque TLC et laissez-le sécher.</li>
	<li>À un bécher de 150 mL, ajouter suffisamment de phase mobile (hexane 90:10 : isopropanol) pour recouvrir le fond du bécher. À l’aide d’une pince à épiler, placez soigneusement la plaque TLC ci-dessus dans le bécher en veillant à ce que la plaque TLC entre uniformément dans la phase mobile. Couvrir le dessus du bécher avec un morceau de papier d’aluminium. REMARQUE: Assurez-vous que la phase mobile ne couvre pas la ligne et l’échantillon tacheté.</li>
	<li>Laissez la phase mobile remonter la plaque TLC jusqu’à ce qu’elle se trouve à environ 1 cm sous le haut de la plaque. Retirez la plaque TLC et, à l’aide d’un crayon, tracez une ligne indiquant la distance parcourue par la phase mobile. Laissez sécher la plaque TLC dans une hotte.</li>
	<li>Une fois séchée, placez la plaque TLC dans un bécher contenant une petite quantité de solide I2 et recouvrez le bécher d’un morceau de papier d’aluminium. Surveillez le TLC pour le développement de taches jaunes / brunes. Une fois développée, retirez la plaque TLC et marquez l’emplacement des taches à l’aide d’un crayon (Figure supplémentaire 1). REMARQUE: Si I2 taches ne sont pas marquées, la tache se dissipera avec le temps. Les taches peuvent également être visualisées sur la plaque TLC par la lumière UV, la coloration au p-anisaldéhyde ou la coloration au permanganate de potassium (voir Informations supplémentaires).</li>
	<li>Calculez les valeurs Rf pour tous les points visualisés à l’aide de la formule suivante : Rf = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg"></li>
	<li>Considérons la réaction comme terminée lorsqu’un seul point avec Rf = 0,3 est visible sur la plaque TLC. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite et sécher le produit brut (obtenu sous forme d’huile brun jaunâtre) sous vide poussé jusqu’à ce que tout le méthanol soit évaporé.</li>
	<li>Dissoudre le produit brut séché dans 30 mL d’acétate d’éthyle et le transférer dans un entonnoir de séparation. Extraire séquentiellement l’acétate d’éthyle avec 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), solution saturée de NaHCO 3 (2 x 30 mL),H2O (30 mL) et solution saturée de NaCl (2 x 30 mL). Jetez les couches aqueuses. REMARQUE: La couche d’acétate d’éthyle est la couche supérieure dans chacune des extractions. Pour chaque extraction, agiter vigoureusement l’entonnoir séparateur contenant l’acétate d’éthyle et la solution aqueuse (HCl,H2O, NaHCO3 ou NaCl) et laisser les couches se séparer complètement.</li>
	<li>Retirez la couche d’acétate d’éthyle de l’entonnoir de séparation et recueillez-la dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajouter une spatule pleine de Na2SO4 (anhydre) pour éliminer l’eau résiduelle de l’acétate d’éthyle. REMARQUE: La solution d’acétate d’éthyle est considérée comme sèche lorsque Na2SO4 dans la fiole coule librement et ne s’agglutine pas. Si Na2SO4 s’agglutine, une spatule supplémentaire de Na2SO4 peut être ajoutée.</li>
	<li>Filtrer la solution d’acétate d’éthyle séchée à travers le papier filtre n ° 1 pour éliminer Na2SO4. Lavez le papier filtre avec une petite quantité d’acétate d’éthyle. Placer la solution d’acétate d’éthyle filtrée dans une fiole à fond rond et retirer le solvant sur un évaporateur rotatif sous pression réduite pour obtenir de la masarimycine sous forme d’huile une fois que tout l’acétate d’éthyle est retiré.</li>
	<li>Dissoudre l’huile de masarimycine obtenue ci-dessus en une quantité minimale (1-2 mL) d’hexane 9:1: isopropanol et remuer sur une plaque magnétique jusqu’à ce que tout le composé soit dissous.</li>
	<li>Purifier la masarimycine dissoute par chromatographie flash à l’aide d’une colonne flash de silice en phase normale de 12 g.<ol>
<li>Équilibrez la colonne flash avec 10 volumes de colonne de phase mobile (hexane 99:1 : isopropanol) avec l’instrument réglé à un débit de 15 mL/min. REMARQUE: Une fois l’équilibrage terminé, arrêtez le flux et déconnectez le haut de la colonne du système.</li>
		<li>Prélever la masarimycine dissoute à l’aide d’une seringue de 5 ml. Connectez la seringue directement au sommet de la colonne flash équilibrée et injectez la solution dans la colonne. Reconnectez la colonne chargée au système de chromatographie flash et lancez l’élution du gradient.</li>
		<li>Eluter masarimycine de la colonne en utilisant l’élution de gradient à une concentration finale de phase mobile de 10:90 hexane: isopropanol sur 12 volumes de colonne. Surveiller l’élution de la masarimycine par absorption à 230 et 254 nm.</li>
		<li>Recueillir les composés élués de la colonne par un collecteur de fraction qui recueille 20 mL de solvant par fraction. REMARQUE: Si un système de chromatographie flash n’est pas disponible, la purification de la masarimycine peut être effectuée via une colonne de silice gravitaire avec une phase mobile 3: 1 (hexane: acétate d’éthyle). Les fractions contenant de la masarimycine peuvent être identifiées par TLC en utilisant la même phase mobile. La visualisation des taches TLC a été effectuée avec une lumière UV, de la vapeur I2 ou une coloration au permanganate de potassium.</li>
		<li>Identifier les fractions contenant de la masarimycine par TLC (étapes 2.5-2.9) ou spectrométrie de masse sur un spectromètre de masse compact équipé d’une sonde d’analyse des solides atmosphériques. Sécher le produit final sous vide (~0,3 mbar). REMARQUE: La masarimycine est systématiquement obtenue sous forme d’huile incolore ou solide avec un rendement de 55% à 70% par rapport au mmol de cyclohexyl carboxaldéhyde ajouté à la réaction. Calculer le rendement final de la masarimycine en obtenant la masse de la masarimycine purifiée et en calculant le rendement théorique de la réaction en utilisant la formule suivante: % de rendement = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg"> x 100 %</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmer la structure de la masarimycine par RMN.<ol>
<li>Dissoudre ~10 mg d’échantillon de masarimycine dans 0,5 mL de CDCl3. À l’aide d’un pipet Pasteur, transférer la solution dans un tube RMN de 5 mm et boucher le tube. Placez le tube RMN dans le spectromètre.</li>
		<li>Acquérir des spectres RMN 1H et 13C à l’aide d’expériences prédéfinies par le fabricant. Les affectations de décalage chimique et les spectres représentatifs sont fournis dans les figures supplémentaires 3 à 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Conserver la masarimycine sèche ou dissoute dans du DMSO (concentration finale de 25 mM) à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>3. Procédure micro-ondes pour la préparation de la masarimycine
<ol><li>Préparer des solutions 0,6 M de cyclohexylamine, de cyclohexylcarboxaldéhyde, d’isocyanure de cyclohexyle et d’acide o-iodobenzoïque dans l’acétonitrile.</li>
	<li>Ajouter une barre d’agitation et 10 mL d’acétonitrile dans un flacon de réaction au micro-ondes en verre.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de cyclohexylamine (0,6 M dans l’acétonitrile), 2 mL de cyclohexyl carboxaldéhyde (0,6 M dans l’acétonitrile) et 7 mL d’acétonitrile dans le flacon.</li>
	<li>Placez le flacon de réaction au micro-ondes dans le carrousel à micro-ondes. Remuez le mélange, chauffez-le pendant 30 min à 50°C à une puissance de 400 W et laissez-le refroidir à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 2 mL d’acide o-iodobenzoïque (0,6 M dans le méthanol) et 2 mL d’isocyanure de cyclohexyle (0,6 M dans l’acétonitrile) au flacon. Remuez le mélange, chauffez-le à 100 °C au micro-ondes pendant 40 min à une puissance de 400 W et laissez-le refroidir à température ambiante.</li>
	<li>Surveiller la progression de la réaction par TLC (hexane 90:10 : isopropanol) à l’aide de vapeurI2 après la fin de l’étape 3.5. REMARQUE : Si la TLC montre que la réaction est incomplète (c.-à-d. plusieurs taches sur la TLC), replacez le flacon de réaction dans le micro-ondes et réglez les conditions de micro-ondes décrites à l’étape 3.5.</li>
	<li>Une fois la réaction terminée, versez la solution dans une fiole à fond rond de 100 mL et évaporez-la à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif.</li>
	<li>Suivez les étapes 2.6 à 2.16 ci-dessus pour terminer le bilan aqueux, la purification et la caractérisation de la masarimycine.</li>
</ol>4. Essai de synergie et d’antagonisme
<ol><li>Cultiver Streptococcus pneumoniae R6 sur des plaques de gélose de Mueller-Hinton (MH) contenant 5 % (v/v) de sang de mouton à 37 °C dans des conditions anaérobies. Dans toutes les expériences, utiliser des cellules de deuxième passage cultivées dans 5 mL de bouillon MH à 37 °C dans des conditions anaérobies jusqu’à ce que l’OD600 soit d’environ 0,4.</li>
	<li>Soumettre les inhibiteurs masarimycine et optochine à des dilutions en série 1:2 dans des solvants respectifs, les concentrations résultantes flanquant les valeurs minimales de concentration inhibitrice (CMI) de chaque inhibiteur.<ol>
<li>Effectuer la dilution initiale de la masarimycine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) jusqu’à ce qu’une concentration de 100 μM soit atteinte. À partir de ce point, faites des dilutions de masarimycine dans le bouillon MH. Préparer la solution mère d’optochine (3,5 mM) en dissolvant l’optochine disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans un bouillon stérile de MH. REMARQUE: Les solutions mères de masarimycine ont été fabriquées à 25 mM en DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À une plaque stérile de microtitrage de 96 puits, ajouter 2 aliquotes μL de chaque dilution optochine à chaque rangée de la plaque. Sur la même plaque, ajouter 2 aliquotes μL de chaque dilution de masarimycine à chaque colonne pour créer un tableau de concentrations d’optochine et de masarimycine sur la plaque (Figure 2).</li>
	<li>Ajouter un bouillon stérile de MH (93 μL) à chaque puits contenant les inhibiteurs ci-dessus. Inoculer les plaques de microtitrage avec 5 μL de culture (OD600 ~ 0,4) à partir de l’étape 4.1. REMARQUE: L’inoculation de la plaque de 96 puits se fait généralement dans des conditions anaérobies dans un poste de travail anaérobie. Le volume final dans le puits est de 100 μL.</li>
	<li>Cultiver des cultures pendant 18 h à 37 °C dans des conditions anaérobies, suivies de l’ajout de 30 μL de solution à 0,01 % (m/v) de sel de résazurine sodique. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 min pour permettre la formation et la stabilisation de la couleur. REMARQUE: La solution de résazurine est préparée en dissolvant le composé dans de l’eau distillée et peut être conservée à 4 ° C pendant deux semaines maximum.</li>
	<li>Lisez directement les valeurs de concentration de la plaque et attribuez la concentration d’inhibiteur la plus faible pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée (couleur bleue) comme [X] (voir étape 4.7.1), c’est-à-dire la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en présence du co-médicament. REMARQUE: La croissance bactérienne positive est identifiée dans les puits par le colorant de résazurine qui devient rose. Les valeurs de CMI pour chaque médicament seul (c.-à-d. en l’absence de co-médicament) sont déterminées de la même manière à l’aide du test de CMI de résazurine35 avec chaque médicament séparément (figure supplémentaire 5). Les CMI chez S. pneumoniae sont de 7,8 μM et 15,85 μM pour la masarimycine et l’optochine, respectivement.</li>
	<li>Déterminer la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) et l’indice FIC (FICI) à l’aide des équations suivantes.<ol>
<li>FIC= [X]/MICx, où [X] (à partir de l’étape 4.6) est la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en présence du co-médicament, et MICx est la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en l’absence du co-médicament.</li>
		<li>FICI = FICmasarimycine +antibiotique FIC NOTE: FICI &lt; 0,5 = synergique, 0,5 &lt; FICI &lt; 1 = additif, 1 &lt; FICI &lt; 4 = indifférent, FICI &gt; 4 = antagoniste.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Étude morphologique
<ol><li>Cultivez Bacillus subtilis 11774 sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl) contenant 1,5 % de gélose Bacto à 37 °C. Dans toutes les expériences, utiliser des cellules de deuxième passage cultivées dans 5 mL de bouillon LB à 37 °C jusqu’à OD600 = 1. Cultivez S.pneumoniae de la même manière qu’à l’étape 4.1.</li>
	<li>Après avoir obtenu une densité de culture cellulaire avec OD600nm = 1 pour B. subtilis, ou OD600nm = 0,4 pour S. pneumoniae, ajouter la masarimycine à l’aide d’une pipette au tube de culture étiqueté " traité » à une concentration finale de 3,8 μM (0,75x MIC pour B.subtilis), ou 5,85 μM (0,75x MIC pour S.pneumoniae). Au deuxième tube de culture étiqueté « témoin », ajoutez un volume équivalent de DMSO.</li>
	<li>Pour B.subtilis, placer les échantillons dans un incubateur à 37 °C pendant 90 min en agitant à 150 tr/min. Pour S. pneumoniae, incuber les cellules sans trembler dans des conditions anaérobies.</li>
	<li>Après 90 min, fixer chimiquement les cultures dans un mélange 1:10 (v/v) de milieux de culture et de tampon de fixation (20 mM HEPES, 1% de formaldéhyde (pH 6,8)) à 4 °C pendant la nuit. Une fois la fixation terminée, appliquez 10 à 20 μL d’échantillons sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une pipette et laissez-les sécher à l’air. Fixez les échantillons séchés à l’air en chauffant les lames de verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.</li>
	<li>Après fixation à la chaleur, tacher les échantillons avec l’ajout de 100 μL de bleu de méthylène à 0,1 % (m/v) (solution dans de l’éthanol à 20 % (v/v)). Incuber les lames tachées pendant 10 min et laver l’excès de colorant avec dH2O. Ensuite, chauffer doucement les lames colorées à 60 ° C dans un four pendant 15-20 min pour amener les cellules à un plan focal commun.</li>
	<li>Scellez les échantillons colorés en plaçant un couvercle de microscope sur les cellules colorées. Ensuite, scellez les bords à l’aide de ciment à lame de microscope. Placez la lame de microscope scellée sur la scène du microscope et mettez l’image au point à un grossissement de 100x à l’aide de la microscopie à champ lumineux.</li>
	<li>Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lame du microscope et mettez le champ de vision au point en utilisant un grossissement de 1000x. Acquérir des micrographies à l’aide d’une caméra fixée au microscope et à son logiciel associé. Obtenez des images à l’aide des paramètres de balance des blancs et d’ouverture automatiques du logiciel. REMARQUE: Alternativement, les images peuvent être traitées à l’aide du logiciel open source ImageJ.</li>
</ol>

Reid, C. W. a une propriété intellectuelle impliquant des applications spécifiques de la masarimycine.

La masarimycine est un inhibiteur bactériostatique micromolaire unique de la croissance de B. subtilis35 et de S. pneumoniae37 . Chez B. subtilis, il a été démontré que la masarimycine inhibe le GlcNAcase LytG35, tandis que la cible moléculaire précise dans la paroi cellulaire de S. pneumoniae n’a pas été identifiée37. La synthèse de la masarimycine à l’aide de la synthèse organique classique ou de l...

Le peptidoglycane (PG) est un polymère en forme de maille qui délimite la forme et la structure des cellules dans les bactéries Gram positif et Gram négatif 1,2. Cet hétéropolymère est une matrice de sucres aminés réticulés par de courts peptides 3,4,5,6 avec un squelette composé de résidus de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétylmuramique (MurNAc) β(1,4)-liés (Figure 1)1. Attaché à la fraction lactyle C-3 de MurNAc est le peptide de la tige. Le métabolisme du PG implique un système étroitement coordonné d’enzymes biosynthétiques et dégradatives pour incorporer de nouveaux matériaux dans la paroi cellulaire 7,8. La dégradation du PG est effectuée par des enzymes collectivement appelées autolysines9 et classées en fonction de la spécificité de la liaison clivée. Les autolysines participent à de nombreux processus cellulaires, notamment la croissance cellulaire, la division cellulaire, la motilité, la maturation du PG, la chimiotaxie, la sécrétion de protéines, la compétence génétique, la différenciation et la pathogénicité10,11. Démêler les fonctions biologiques spécifiques des autolysines individuelles peut être intimidant, en partie à cause de la redondance fonctionnelle. Cependant, des études biophysiquesrécentes 8,12,13 et des études computationnelles12 ont fourni de nouvelles informations sur leurs rôles dans le métabolisme du PG. En outre, des rapports récents ont fourni des informations supplémentaires sur la synthèse14 et les 15,16,17 étapes médiées par membrane dans le métabolisme du PG. Une compréhension approfondie de la relation entre les voies dégradatives et synthétiques du métabolisme du PG pourrait donner lieu à des cibles antibiotiques inexploitées auparavant.
Bien qu’il y ait eu des progrès significatifs dans la méthodologie pour étudier la glycobiologie chez les eucaryotes, la glycobiologie bactérienne et, en particulier, le métabolisme pg n’a pas progressé à un rythme similaire. Les approches chimiques actuelles pour étudier le métabolisme du PG comprennent les antibiotiques marqués par fluorescence18, les sondes fluorescentes19,20 et le marquage métabolique 21,22,23,24. Ces nouvelles approches offrent de nouvelles façons d’interroger le métabolisme de la paroi cellulaire bactérienne. Bien que certaines de ces stratégies soient capables de marquer le PG in vivo, elles peuvent être spécifiques àl’espèce 19, ou ne fonctionner que dans des souches dépourvues d’une autolysine25 particulière. De nombreuses stratégies de marquage du PG sont destinées à être utilisées avec des parois cellulaires isolées26 ou avec des voies de biosynthèse de PG reconstituées in vitro 20,27,28. L’utilisation d’antibiotiques marqués par fluorescence est actuellement limitée aux étapes biosynthétiques et à la transpeptidation18.
Les connaissances actuelles sur les autolysines bactériennes et leur rôle dans le métabolisme de la paroi cellulaire proviennent de l’analyse génétique et biochimique in vitro 11,29,30,31,32. Bien que ces approches aient fourni une mine d’informations sur cette classe importante d’enzymes, il peut être difficile de déchiffrer leur rôle biologique. Par exemple, en raison de la redondance fonctionnelle33, la suppression d’une autolysine dans la plupart des cas n’entraîne pas l’arrêt de la croissance bactérienne. Ceci malgré leur rôle implicite dans la croissance et la divisioncellulaires 7,12. Une autre complication est que la délétion génétique des autolysines bactériennes peut donner naissance à des méta-phénotypes34. Les métaphénotypes proviennent de l’interaction complexe entre la voie affectée par la délétion génétique et d’autres voies interconnectées. Par exemple, un méta-phénotype peut survenir via un effet direct tel que l’absence d’une enzyme, ou un effet indirect tel qu’une perturbation des régulateurs.
Actuellement, il n’existe que quelques inhibiteurs des autolysines glycosidases telles que les N-acétylglucosaminidases (GlcNAcase) et les N-acétylmuramidases, qui peuvent être utilisées comme sondes chimiques pour étudier la dégradation du PG. Pour y remédier, le diamide masarimycine (précédemment appelé fgkc) a été identifié et caractérisé35 comme un inhibiteur bactériostatique de la croissance de Bacillus subtilis qui cible le GlcNAcase LytG32 (Figure 1). LytG est un GlcNAcase36 à action exo-agissante, membre du groupe 2 de la famille des glycosyl hydrolases 73 (GH73). C’est le principal GlcNAcase actif au cours de la croissance végétative32. À notre connaissance, la masarimycine est le premier inhibiteur d’un GlcNAcase à action PG qui inhibe la croissance cellulaire. Des études supplémentaires sur la masarimycine avec Streptococcus pneumoniae ont révélé que la masarimycine inhibe probablement le métabolisme de la paroi cellulaire dans cet organisme37. Ici, la préparation de masarimycine est rapportée pour une utilisation comme sonde de biologie chimique pour étudier la physiologie dans les organismes à Gram positif B. subtilis et S. pneumoniae. Des exemples d’analyse morphologique d’un traitement à concentration inhibitrice inférieure au minimum avec de la masarimycine, ainsi qu’un test de synergie/antagonisme sont présentés. Les tests de synergie et d’antagonisme utilisant des antibiotiques avec des modes d’action bien définis peuvent être un moyen utile d’explorer les connexions entre les processus cellulaires 38,39,40.

<table><tbody><tr><td>Acide 2-iodobenzoïque</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>corrosif, irritant, poudre jaune clair à brun orangé</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>liquide inflammable, irritant, incolore</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td><td>liquide inflammable, irritant, incolore</td></tr><tr><td>Plaques de silice à dos d’aluminium</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>gel de silice XG F254 sur plaques à support aluminium</td></tr><tr><td>chloroform-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>solvant pour</td></tr><tr><td>spectromètre de masse compact</td> RMN <td>Advion-Interchim</td> Spectromètre de masse compact <td>Advion CMS</td><td>équipé d’une source APCI et d’une sonde d’analyse des solides atmosphériques</td></tr><tr><td>Corning Costar 96 plaques à fond plat de puits - stérile</td><td>Fisher Chemical</td><td>07-200-90</td><td>pour les dosages de synergie/antagonisme</td></tr><tr><td>lamelles de recouvrement fisher</td><td>chemical</td><td>12-547</td><td>pour la microscopie</td></tr><tr><td>Cyclohexanecarboxaldéhyde</td><td>CHEM-IMPEX INT’L INC.</td><td>24451</td><td>inflammable, irritant, incolore à rose</td></tr><tr><td>Cyclohexyl isocyanure</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>irritant, liquide incolore, odeur extrêmement désagréable</td></tr><tr><td>Cyclohexylamine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>corrosif, inflammable, irritant, liquide incolore sauf contaminé</td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>inflammable, irritant, incolore </td></tr><tr><td>cartouche de silice flash liquide (12g)</td><td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>pack de colonnes de silice flash (12g) pour la purification de masarimycine</td></tr><tr><td>formaldéhyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>agent de fixation pour la microscopie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>tampon pour solution de fixation de microscopie</td></tr><tr><td>Hexane, mélange d’isomères</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>nocif pour l’environnement, inflammable, irritant, dangereux pour la santé, liquide incolore</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse compact haute performance</td><td>Advion</td><td>expression</td><td>Sonde d’analyse des solides atmosphériques (ASAP), basse résolution</td></tr><tr><td>High Vac</td><td>eppendorf</td><td>Vacufuge plus</td><td>vide assisté par la force centrifuge et la température</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>corrosif, irritant, incolore liquide</td></tr><tr>acide<td>chlorhydrique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>huile d’immersion</td> acide fort <td>Fisher chimique</td><td>12-365-19</td><td>pour la microscopie</td></tr><tr><td>Iode, cristaux resublimés</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>dommageable pour l’environnement, irritant, dangereux pour la santé, cristaux gris foncé/violet</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>logiciel pour le traitement des spectres RMN</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>inflammable, toxique, dangereux pour la santé, liquide incolore</td></tr><tr><td>bleu de méthylène</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>coloration microscopique pour coloration des parois cellulaires</td></tr><tr><td>plaques de gélose meuller-hinton + 5 % de sang</td><td>de mouton Fisher B21176X</td><td></td><td>milieu de croissance pour Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>bouillon meuller-hinton</td><td>Fisher Chemical</td><td>DF0757-17-6</td><td>Milieu de croissance pour lames de microscope Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Chemical</td><td>22-310397</td><td>pour la microscopie</td></tr><tr><td>Laboratoire de synthèse par micro-ondes</td><td>MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>appareil qui nécessite la ventilation d’une hotte, équipé de tubes RMN à carrousel</td></tr><tr><td></td><td>de synthèse SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>Tubes RMN de 5 mm 600 MHz</td></tr><tr><td>Résonance magnétique nucléaire (RMN)</td><td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>grand aimant supraconducteur (400MHz)</td></tr><tr><td>optochin</td><td>fisher</td><td>AAB21627MC</td><td>chimique éthylhydrocupreine chlorhydrate</td></tr><tr><td>de Pétrie</td><td>plaques Celltreat</td><td>229695</td><td>pour la préparation de plaques de gélose pour la croissance bactérienne</td></tr><tr><td>Primo Star Microscope à champ clair/contraste de phase avec caméra ERc5s</td><td>Zeiss</td><td></td><td>pour études morphologiques</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>système de purification par chromatographie flash</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>pour les dosages de synergie/antagonisme</td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Valeur « The Collegiate »</td> <td>Évaporateur à solvant</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>irritant, blanc poudre</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>cristallin, incolore</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>pour la croissance de B.subtilis et la préparation du milieu LB</td></tr><tr><td>Sulfate de sodium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>tryptone anhydre, granuleux, blanc</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Fisher chimique BP1421-500</td><td>pour la croissance de B.subtilis et préparation des milieux LB</td></tr><tr><td>Whitney DG250 Workstation</td><td>Microbiology International</td><td>DG250</td><td>poste de travail anaérobie. Mélange gazeux anaérobie utilisé : 5 % d’hydrogène, 10 % de dioxyde de carbone, équilibre azote</td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>chimique Fisher</td><td>BP1422-500</td><td>pour la croissance de B.subtilis et préparation du support LB</td></tr><tr><td>Logiciel Zen Lite (bleu)</td><td>Zeiss pour l’acquisition</td><td></td><td>de micrographies</td></tr></tbody></table>

synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à gram positif

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Le peptidoglycane (PG) dans la paroi cellulaire des bactéries est une structure macromoléculaire unique qui confère une forme et une protection contre l’environnement environnant. Au cœur de la compréhension de la croissance et de la division cellulaires se trouve la connaissance de la façon dont la dégradation du PG influence la biosynthèse et l’assemblage de la paroi cellulaire. Récemment, le marquage métabolique du PG par l’introduction de sucres ou d’acides aminés modifiés a été rapporté. Alors que l’interrogation chimique des étapes biosynthétiques avec de petites molécules inhibitrices est possible, les outils de biologie chimique pour étudier la dégradation du PG par les autolysines sont sous-développés. Les autolysines bactériennes sont une large classe d’enzymes qui sont impliquées dans la dégradation étroitement coordonnée du PG. Ici, un protocole détaillé est présenté pour la préparation d’une sonde à petite molécule, la masarimycine, qui est un inhibiteur de la N-acétylglucosaminidase LytG dans Bacillus subtilis, et le métabolisme de la paroi cellulaire chez Streptococcus pneumoniae. La préparation de l’inhibiteur par micro-ondes et la synthèse organique classique est fournie. Son applicabilité en tant qu’outil d’étude de la physiologie à Gram positif dans les essais biologiques est présentée.

La masarimycine est une petite molécule inhibitrice bactériostatique de B. subtilis et S. pneumoniae et il a été démontré qu’elle inhibe l’exo-action GlcNAcase LytG chez B. subtilis35,37 et cible la paroi cellulaire chez S. pneumoniae37. La masarimycine peut être préparée efficacement par la synthèse organique classique ou assistée par micro-ondes avec des rendements compris entre 55% et 70%. La synthèse...

Un protocole détaillé est présenté pour la préparation du diamide bactériostatique masarimycine, une sonde à petites molécules qui inhibe la croissance de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae en ciblant la dégradation de la paroi cellulaire. Son application en tant que sonde chimique est démontrée dans des essais de synergie/antagonisme et des études morphologiques avec B. subtilis et S. pneumoniae.

Synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

La masarimycine est l’un des rares inhibiteurs des autolysines bactériennes qui arrête la croissance cellulaire bactérienne. Il peut être utilisé pour étudier les différences entre l’inactivation chimique et génétique des autolysines, et fournit une approche orthogonale de la génétique pour étudier la physiologie bactérienne. La synthèse de la masarimycine peut sembler intimidante.Suivez attentivement les étapes indiquées. En cas de doute sur le fonctionnement d’une étape de réaction, confirmez par chromatographie sur couche mince et les modifications des valeurs RF. Pour commencer, préparez une solution 0,1 molaire de cyclohexylamine, de cyclohexylcarboxaldéhyde, d’acide ortho-iodobenzoïque et d’isocyanure de cyclohexyle dans du méthanol.Ajouter la barre d’agitation magnétique, puis mélanger cinq millilitres de cyclohexylamine et cinq millilitres de cyclohexyl carboxaldéhyde dans une fiole à fond rond coiffée et placer la fiole dans un bain de sable sur un agitateur à plaque chauffante pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius. Surveillez la température à l’aide d’un thermomètre placé à environ un centimètre sous la surface du sable. Après 30 minutes, ajouter cinq millilitres d’isocyanure de cyclohexyle à la solution et remuer pendant 20 minutes supplémentaires à 50 degrés Celsius.Ensuite, ajoutez cinq millilitres d’acide ortho-iodobenzoïque au mélange réactionnel et continuez à remuer à 55 degrés Celsius pendant trois à cinq heures. Après trois heures d’agitation, surveillez périodiquement la progression de la réaction par chromatographie sur couche mince, ou TLC, à des intervalles d’environ une heure. Considérons la réaction comme terminée lorsqu’un seul point avec un facteur de rétention égal à 0,3 est visible sur la plaque TLC.Retirez le solvant dans l’évaporateur rotatif sous pression réduite. Une fois que tout le méthanol est évaporé, dissoudre le produit brut séché dans 30 millilitres d’acétate d’éthyle et le transférer dans un entonnoir de séparation. Extraire séquentiellement l’acétate d’éthyle avec de l’acide chlorhydrique à une molaire, de l’eau, une solution saturée de bicarbonate de sodium, de l’eau à nouveau et une solution saturée de chlorure de sodium, en éliminant les couches aqueuses à chaque extraction.Ensuite, retirez la couche d’acétate d’éthyle de l’entonnoir de séparation et collectez-la dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajouter une spatule pleine de sulfate de sodium anhydre pour éliminer l’eau résiduelle de l’acétate d’éthyle. Filtrer la solution d’acétate d’éthyle séchée à travers un papier filtre numéro un pour éliminer le sulfate de sodium.Ensuite, lavez le papier filtre avec une petite quantité d’acétate d’éthyle. La solution d’acétate d’éthyle filtrée a été évaporée à sec sur un évaporateur rotatif sous pression réduite pour obtenir de la masarimycine sous forme d’huile une fois que tout l’acétate d’éthyle est retiré. Dissoudre l’huile de masarimycine dans un à deux millilitres d’une solution d’hexane 9:1 en isopropanol et remuer sur une plaque magnétique jusqu’à ce que le composé entier soit dissous.Pour purifier la masarimycine dissoute, effectuez une chromatographie flash avec une colonne flash de silice de 12 grammes, en phase normale. Équilibrez la colonne flash avec 10 volumes de colonne de phase mobile avec les instruments réglés à un débit de 15 millilitres par minute. Une fois l’équilibrage terminé, prélever la masarimycine dissoute à l’aide d’une seringue de cinq millilitres.Connectez la seringue directement au sommet de la colonne flash équilibrée et injectez la solution dans la colonne. Reconnectez la colonne chargée au système de chromatographie flash et lancez l’élution du gradient. Eluter masarimycine de la colonne en utilisant l’élution de gradient à une concentration finale de phase mobile de 10:90 hexane en isopropanol sur 12 volumes de colonne.Surveillez l’élution de la masarimycine par absorption à 230 et 254 nanomètres. Pour l’étude de morphologie, cultivez bacillus subtilis 11774 sur des plaques de gélose LB à 37 degrés Celsius. Dans toutes les expériences ultérieures, utilisez des cellules de deuxième passage cultivées dans cinq millilitres de bouillon LB jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1.Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajouter la masarimycine aux tubes de culture marqués traités à une concentration finale de 3,8 micromoles. Pour les tubes de culture étiquetés témoins, ajouter un volume équivalent de DMSO. Placez les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes en agitant à 150 tr / min.Après 90 minutes, fixez chimiquement les cultures dans un mélange 1:10 de milieux de culture et de tampon de fixation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez une pipette pour appliquer 10 à 20 microlitres des échantillons chimiquement fixés sur des lames de microscope en verre et les laisser sécher à l’air. Ensuite, fixez à la chaleur les échantillons séchés à l’air en chauffant les lames de verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.Après fixation thermique, tacher les échantillons avec 100 microlitres de bleu de méthylène à 0,1%. Après une incubation de 10 minutes avec la tache, lavez l’excès de colorant avec de l’eau distillée. Ensuite, chauffez doucement les lames colorées à 60 degrés Celsius dans un four pendant 15 à 20 minutes pour amener les cellules à un plan focal commun.Scellez les échantillons colorés en plaçant un couvercle de microscope sur les cellules colorées. Ensuite, scellez les bords à l’aide de ciment à lame de microscope. Placez la lame de microscope scellée sur la scène du microscope et mettez l’image au point à un grossissement de 100X à l’aide de la microscopie à champ lumineux.Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lame du microscope et mettez le champ de vision au point à l’aide d’un grossissement de 1000X. Acquérir des micrographies à l’aide d’une caméra fixée au microscope et à son logiciel associé. Obtenez des images à l’aide des paramètres de balance des blancs et d’ouverture automatiques du logiciel.La chromatographie flash permet une purification rapide de la masarimycine avec une grande pureté. L’évaluation de la synergie ou de l’antagonisme avec l’inhibiteur de l’ATPase optochine chez S.pneumoniae est présentée ici. La concentration la plus faible du composé pour inhiber la croissance bactérienne, indiquée par la couleur bleue, est considérée comme la valeur minimale de concentration inhibitrice en présence d’un co-médicament.En revanche, les puits de couleur rose indiquent une croissance bactérienne. Les essais phénotypiques utilisant la masarimycine à 0,75 fois les concentrations inhibitrices minimales ont démontré un phénotype semblable à celui de la saucisse pour B.subtilis et un phénotype agglutinant pour S.pneumoniae. Faites attention à la température de la réaction.Assurez-vous que la réaction est complète en surveillant avec TLC. Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec des antibiotiques marqués par fluorescence pour étudier les modifications de la paroi cellulaire par microscopie.

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La biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A...

La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

Nous présentons ici un protocole détaillé de (A) l'identification d'un produit naturel avec une activité antibiotique, (B) la purification du composé, (C) le premier modèle de sa biosynthèse, (D) le séquençage du génome / -mining et ( E) la vérification du groupe de gènes de biosynthèse.

D'un produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Un protocole d’extraction du génome guidé par spectrométrie de masse est établi et décrit ici. Il est basé sur l’information sur la séquence génomique et l’analyse LC-MS/MS et vise à faciliter l’identification des molécules à partir d’extraits microbiens et végétaux complexes.

L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels

Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.

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Synthèse et dosage d’inhibiteurs de détection du quorum de Vibrio

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

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Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Ce protocole décrit une méthode pour produire et évaluer l’activité antimicrobienne et la cytotoxicité du peptide cationique Mel4 et du mimétique du peptide RK758. En intégrant la synthèse chimique, l’expression recombinante et les tests fonctionnels standardisés, il offre un flux de travail simplifié pour la production et le test de peptides et de mimiques de petites molécules.

Production et test de peptides antimicrobiens et de leurs mimiques

Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Découvrez la synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif. Ce protocole détaillé utilise la chromatographie sur couche mince et la chromatographie éclair pour purifier le composé.

Synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif

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