Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T
21 avril 2022
Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.
Nous avons mis en place une technologie de plate-forme pour le SRAS COVID 2 qui peut être applicable à d’autres virus avec la reconnaissance cellulaire médiée par Spike et l’entrée comme première étape de l’infection virale cellulaire. Les points quantiques sont brillants, stables et leur surface peut être fonctionnalisée pour une variété d’applications cellulaires. En utilisant cette méthode, nous pouvons visualiser et mesurer l’internalisation de Spike dans les cellules.
Pour préparer 0,1%BSA. Ajouter 130 microlitres de 7,5 % de BSA à 10 millilitres de supports d’imagerie en mélange. Pour une dilution en série de 6,1 à trois et un triple, ajoutez 14,26 microlitres de QD Spike à 285,74 microlitres du 0,1% BSA pour obtenir la concentration la plus élevée de 20 nanomoles.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de 20 nanomoles ou QD Spike à 200 microlitres de 0,1% BSA pour faire la deuxième illusion de 6,67 nanomoles QD Spike. Retirez tous les supports usés de chaque puits à l’aide d’un aspirateur multicanal, lavez une fois avec une pipette multicanal avec 100 microlitres de supports d’imagerie par puits, puis aspirez 100 microlitres du support d’imagerie. Ajoutez 50 microlitres de solution QD Spike par puits et incubez la plaque pendant trois heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
En portant un équipement de protection, préparez des supports d’imagerie à 4 % de PFA et 0,1 % de PSA à l’intérieur d’une armoire de biosécurité stérile, aspirez 50 microlitres de QD Spike de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de 4 % de PFA par puits avec une pipette multicanal automatisée pour éviter de sécher les puits. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver trois fois avec du PBS, préparer le colorant nucléaire rouge foncé en diluant la solution mère de cinq millimètres à un à 1000 dans du PBS, aspirer le PBS et ajouter 50 microlitres de colorant nucléaire dilué par puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante puis laver trois fois avec du PBS, imager la plaque ou la sceller à l’aide d’un scellant à plaques pour l’imagerie ultérieure.
Conservez la plaque à quatre degrés Celsius. Démarrez le logiciel de la plate-forme d’imagerie. Après avoir connecté à la plate-forme d’imagerie, créez un nouveau protocole d’acquisition en sélectionnant le type de plaque comme plaque d’imagerie inférieure transparente à 96 parois, sélectionnez le mode optique est devenu focal et le grossissement comme 40 fois l’immersion dans l’eau, sélectionnez le binning comme un.
Sélectionnez le mode de contraste numérique du visage, tel qu’un contraste élevé, pour produire des corps cellulaires bien définis. Prenez un instantané pour confirmer que ce titre est approprié comme indiqué dans la fenêtre d’image, sélectionnez le canal C approprié à utiliser avec la lignée cellulaire ACE2-GFP pour visualiser le trafic ACE2 dans la cellule. Pour créer un canal QD personnalisé, sélectionnez le menu déroulant triangle et choisissez l’excitation dans la plage de 405 nanomètres en émission dans la gamme de 608 nanomètres, sélectionnez un puits avec un signal QD cytoplasmique robuste pour régler le temps d’exposition, la puissance laser et la position de hauteur Z.
Vérifiez si la hauteur par défaut produit une image des cellules dans le plan focal souhaité. La position Z sera plus basse pour l’endocytose puncta que la position Z pour la membrane plasmique. Choisissez un temps d’exposition, généralement compris entre 100 et 300 millisecondes, qui produit une image lumineuse avec des niveaux de gris, au moins trois fois supérieurs au signal d’arrière-plan.
À 20 nanomoles, les niveaux de gris devraient être d’environ 6 000 unités atomiques avec un temps d’exposition de 200 millisecondes et une puissance laser de 80%. Vérifiez les niveaux de gris en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image produite avec la fonction d’instantané dans chaque canal et en sélectionnant afficher l’intensité, puis cliquez avec le bouton gauche sur l’objet d’intérêt ou l’arrière-plan pour afficher le niveau de gris de ce pixel, ajustez la puissance laser pour affiner l’intensité des objets d’intérêt. Enregistrez le protocole d’acquisition, basculez pour exécuter l’expérience et entrez le nom de la plaque, exécutez l’expérience.
La translocation des QD et de l’ACE2 a été visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP. La segmentation de l’image et l’analyse ultérieure ont été effectuées pour extraire les paramètres pertinents tels que le nombre de points. Tout d’abord, les noyaux ont été segmentés à partir du canal marqueur nucléaire pour créer une population de retour sur investissement.
Ensuite, une région roi décrivant la cellule avec segmenté à l’aide du canal ACE2-GFP. Enfin, les points de pointe QD 608 ont été segmentés à partir de la région roi cellulaire, les signaux QD et ACE2 internalisés ont montré une forte colocalisation. Une expérience de réponse de concentration avec six concentrations différentes de QD Spike a été réalisée dans des cellules HEK 293T.
En déterminant les concentrations optiques de QD, QDS peut être utilisé aussi bas que 2,22 nanomoles, cependant, il est recommandé d’utiliser des concentrations de 10 nanomole ou plus pour assurer une réponse robuste. Au cours de la conjugaison avec l’agrégation de la protéine QD peut se produire. Des agrégats ont été repérés dans la solution QD sous forme de précipités agglomérés brillants et de cellules HEK 293T, les QD ont été incubés avec des anticorps neutralisés à partir de 30 microgrammes par microlitre avant l’ajout aux cellules, ces anticorps ont bloqué l’internalisation de la liaison et ont entraîné une réduction du nombre de points par rapport aux cellules traitées avec QD uniquement.
Cet essai peut également être utilisé pour le dépistage à haut débit, l’évaluation principale des anticorps neutralisants afin d’identifier les antiviraux de jeu de mots à l’entrée virale de bloc et être adapté pour étudier les nouvelles variantes émergentes.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude présente une technologie de plateforme utilisant des points quantiques conjugués à des protéines Spike du SARS-CoV-2 afin de visualiser et de mesurer la liaison de la protéine Spike au récepteur hACE2 sur les membranes cellulaires, ainsi que l'endocytose subséquente de ces protéines dans le cytoplasme. Cette méthode fournit des informations sur les premières étapes de l'infection virale cellulaire et offre une applicabilité étendue à d'autres virus utilisant une entrée médiée par des protéines Spike.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
- Pathogénèse virale
Contexte
- Le SARS-CoV-2 interagit avec l'hACE2 pour l'entrée cellulaire, une étape cruciale de l'infection virale.
- Les points quantiques offrent un moyen stable et efficace de suivre les processus biologiques.
- La compréhension de l'internalisation de la protéine Spike peut faire progresser le développement d'antiviraux.
Méthodes utilisées
- Microscopie à fluorescence pour l'imagerie des processus cellulaires.
- Cellules HEK 293T comme modèle biologique pour l'expérimentation.
- Expériences de réponse à la concentration pour optimiser l'utilisation des points quantiques.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de l'internalisation des protéines Spike et de leur co-localisation avec ACE2.
- Mise en place de concentrations optimales de points quantiques pour des résultats fiables.
- Capacité démontrée d'évaluer l'impact des anticorps neutralisants sur l'entrée du virus.
Conclusions
- L'étude propose une méthodologie novatrice pour suivre les mécanismes d'entrée virale.
- Cette approche pourrait potentiellement conduire à des avancées dans le criblage antiviral et le développement de thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une visualisation à haut débit de la liaison de la protéine Spike virale et de l'endocytose, soutenant la validation précoce de cibles antivirales. En quantifiant les interactions récepteur-ligand et le trafic dans un contexte cellulaire physiologiquement pertinent, elle fournit un dérisquage mécanistique pour les inhibiteurs d'entrée. La plateforme permet le criblage évolutif d'anticorps neutralisants et de composés candidats contre le SARS-CoV-2 et d'autres virus utilisant la protéine Spike.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'observation directe de la liaison de la protéine Spike à l'hACE2 et de l'internalisation subséquente, validant ainsi le mécanisme d'entrée virale comme cible thérapeutique.
- Valeur opérationnelle : Utilise des conjugués de points quantiques comme sondes fluorescentes stables pour suivre la dynamique de la protéine Spike avec un rapport signal/bruit élevé, réduisant les faux négatifs dans les tests de liaison.
- Valeur prédictive : Les données concentration-réponse (par exemple, activation efficace à ≥10 nanomoles de QD Spike) soutiennent la modélisation de l'engagement de la cible dépendant de la dose, utile pour l'optimisation des candidats médicaments.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : La segmentation des noyaux, des cellules exprimant ACE2-GFP et des points de Spike marqués aux points quantiques permet une analyse quantitative du nombre de points pour le criblage à haut contenu d'inhibiteurs de liaison et d'internalisation.
- Valeur opérationnelle : Le protocole comprend des étapes automatisées de fixation, de coloration nucléaire et d'imagerie compatibles avec des formats de plaques de 96 puits, favorisant la standardisation et la reproductibilité des tests.
- Extensibilité : L'utilisation démontrée dans des expériences de réponse à la concentration avec six concentrations et des dilutions en triplets indique une préparation adéquate pour des campagnes de criblage allant du moyen au haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : La co-localisation des points quantiques marquant la protéine Spike internalisée avec ACE2-GFP fournit un indicateur mécanistique permettant d'évaluer les anticorps neutralisants qui bloquent l'entrée virale, orientant directement l'évaluation des candidats thérapeutiques.
- Continuité préclinique : La possibilité de tester l'efficacité des anticorps (par exemple, une réduction du nombre de foyers par des anticorps neutralisants à 30 μg/μL) appuie les décisions d'avancement ajustées au risque dans le développement d'antiviraux.
- Adaptabilité : Cette plateforme peut être appliquée à de nouveaux variants et à d'autres virus utilisant la protéine Spike, renforçant ainsi son utilité à long terme dans les programmes de préparation aux pandémies.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte d'antiviraux, allant de la validation de la cible à l'identification de candidats prometteurs puis à l'évaluation préclinique, permettant une évaluation itérative de composés ciblant la protéine Spike.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant l'interaction entre la protéine Spike et l'ACE2 humain ainsi que les voies d'endocytose, clarifiant ainsi le mécanisme d'action des inhibiteurs d'entrée.
- Criblage : Génère des lectures d'imagerie quantitatives (nombre de points, co-localisation) permettant une comparaison fiable des effets des composés sur la liaison et l'internalisation virales.
- Analytique : Extrait des mesures de nombre et d'intensité des points à partir des canaux segmentés, fournissant des données statistiques pour les profils de réponse dose-dépendante et d'inhibition.
- Recherche translationnelle : Corrèle les données de liaison et d'internalisation avec des résultats fonctionnels (par exemple, réduction de l'entrée de la protéine Spike par anticorps), appuyant les décisions de poursuite ou d'abandon de projet.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole est conçu pour être réutilisé avec différentes cibles et lignées cellulaires, la conjugaison avec des points quantiques pouvant être adaptée à d'autres ligands ou récepteurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Permet une visualisation directe des mécanismes d'entrée virale, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : La stabilité et la luminosité des points quantiques permettent une détection de signal constante d'un essai à l'autre, améliorant la reproductibilité du test.
- Valeur stratégique : Permet d'identifier précocement les inhibiteurs d'entrée efficaces, réduisant le risque d'échec en phase avancée dû à l'absence d'interaction avec la cible.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des candidats-médicaments fondée sur des données quantitatives d'inhibition de l'internalisation, améliorant ainsi l'efficacité du capital alloué aux programmes antiviraux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie de fluorescence, en manipulation des points quantiques et en analyse de segmentation d'images.
- Dépend de systèmes d'imagerie par fluorescence à champ large ou confocale équipés de filtres d'excitation/émission configurables (par exemple, excitation à 405 nm, émission à 608 nm pour les QD608).
- Exige une standardisation entre les équipes concernant la dilution des anticorps, les durées d'incubation et les étapes de lavage afin de minimiser la variabilité des décomptes de points.
- Doit tenir compte de l'agrégation des points quantiques lors de la conjugaison, ce qui nécessite une clarification de la solution (par exemple, par centrifugation ou filtration) avant utilisation.
- L'adaptation à des systèmes autres que les HEK293T peut nécessiter une optimisation de l'expression de l'ACE2 ou le marquage d'un récepteur alternatif pour des études de co-localisation.
