Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

Ainsi, les dérivés de l’acide neurminique ne sont présents que dans les bactéries pathogènes, les flagelles aminiglycosylés contiennent ce sucre. Dans le cadre, la délétion de la région contenue dans les gènes peut aider à trouver des grappes de glycosylation flagelle. Cette technique, la dernière région ou les gènes spécifiques, tels que les glycosyltransférases qui ont une homologie élevée entre eux et sont impliqués dans différents processus, et analyser son implication dans le processus de glycosylation des flagelles.

Cette technique peut également aider à trouver le rôle des glycosyltransférases impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents dans les bactéries pathogènes et aussi le rôle des protéines codant pour les gènes impliquées dans la formation des flagelles. Démonstration de la procédure par Maite Polo, technicienne de mon laboratoire. Concevez deux paires d’amorces qui amplifient les régions d’ADN en amont et en aval du gène ou de la région sélectionnée à supprimer.

Les amorces A et D doivent inclure à l’extrémité des cinq amorces, un site de restriction pour une endonucléase qui permet le clonage dans pDM4. Assurez-vous que les amorces B et C se trouvent dans le gène à supprimer ou à l’intérieur du premier et du dernier gène de la région à supprimer. Assurez-vous que les deux amorces sont dans le cadre et situées entre cinq et six codons à l’intérieur du gène.

Assurez-vous que les deux amorces comprennent une séquence complémentaire de 21 paires de bases à l’extrémité des cinq amorces pour joindre les amplicons d’ADN AB et CD.Utilisez 100 nanogrammes d’ADN chromosomique purifié comme modèle dans deux ensembles de PCR asymétriques avec amorces AB et CD suivies de l’analyse des produits résultants dans du gel d’agarose à 1%. Purifier et quantifier les amplicons excisés du gel électrophorétique. Mélanger 100 nanogrammes de chaque amplicon avec des réactifs PCR sans apprêt.

Après l’avoir étendu, ajoutez des amorces A et D et amplifiez-les en un seul fragment. Ensuite, analysez, purifiez et quantifiez les produits résultants comme décrit précédemment. Digérer un microgramme de pDM4 et 400 nanogrammes d’amplicon AD avec une endonucléase.

Combinez le pDM4 digéré avec l’amplicon AD à un vecteur molaire pour insérer un rapport de un à quatre et préparer la réaction de ligature. Incuber pendant la nuit à 20 degrés Celsius. Plus tard, inactivez la ligase T4 à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Inoculer la souche Escherichia coli dans le bouillon Luria Bertani Miller et incuber à 30 degrés Celsius en agitant à 200 tr / min jusqu’à ce qu’une densité optique comprise entre 0,4 et 0,6 soit observée. Granuler la culture de la bactérie par centrifugation à 5 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Suspendez le granulé dans de l’eau distillée réfrigérée et répétez le processus de nettoyage deux fois de plus.

Transférer la suspension bactérienne dans des tubes de microfuge et répéter la centrifugation à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir remis la pastille dans de l’eau glacée, ajouter environ 3,5 microlitres du mélange de ligature et incuber sur de la glace pendant cinq minutes. Transférer le contenu dans une cuvette d’électroporation réfrigérée de deux millimètres.

Après l’électroporation, ajouter le milieu SOC et transférer le contenu dans un tube de culture. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius en agitant à 200 RPM. Plaquer les cellules transformées sur des plaques de gélose LB complétées par du chloramphénicol.

Vérifiez l’insertion de la construction de suppression dans pDM4 par PCR à l’aide d’amorces qui flanquent le côté clonage pDM4. Préparer des cultures pendant la nuit afin que la souche Aeromonas réceptrice résistante à la rifampicine et deux souches différentes d’Escherichia coli. La souche donneuse avec le plasmide recombinant pDM4 et la souche auxiliaire avec le plasmide PRK 2073 à 30 degrés Celsius.

Suspendre le même nombre de colonies de souches donneuses, receveuses et auxiliaires dans trois tubes LB avec 150 microlitres de LB. Ensuite, sur une plaque de gélose LB sans antibiotiques, mélangez les trois suspensions bactériennes en deux gouttes chez un rapport receveur/aide/donneur de cinq à un pour un, et incubez la plaque face vers le haut pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Récoltez les bactéries en ajoutant un millilitre de bouillon LB à la plaque de gélose LB. Transférer la suspension bactérienne dans un tube de microfuge conique de 1,5 millilitre et vortexr vigoureusement.

Étaler 100 microlitres de la suspension bactérienne sur des plaques de gélose LB avec de la rifampicine et du chloramphénicol. Essorez 200 microlitres et 600 microlitres des échantillons, suspendez la pastille dans 100 microlitres de bouillon LB et plaquez sur gélose LB avec rifampicine et chloramphénicol suivie d’une incubation. Effectuez un test d’oxydase pour confirmer que les colonies sont des Aeromonas.

Confirmer en outre l’insertion du plasmide recombinant pDM4 dans la région chromosomique spécifique par PCR à l’aide des amorces E et F. Cultivez les colonies recombinantes dans deux millilitres de LB avec 10% de saccharose et sans antibiotiques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Après avoir préparé différentes dilutions de culture, plaquer 100 microlitres des cultures bactériennes et des dilutions sur plaque de gélose LB avec 10% de saccharose et incuber pendant la nuit à 30 degrés Celsius.

Le lendemain, ramassez les colonies et transférez-les sur des plaques LB avec et sans chloramphénicol. Après les avoir incubés pendant la nuit à 30 degrés Celsius, sélectionnez les colonies sensibles au chloramphénicol. Analysez les colonies sensibles par PCR à l’aide de la paire d’amorces EF et sélectionnez les colonies dont le produit PCR est en corrélation avec la taille de la construction supprimée.

Mettez une petite goutte de silicone aux quatre coins de la glissière de couverture et montez pendant la nuit la culture cultivée d’Aeromonas sur une glissière de couverture. Placez une glissière excavée sur la glissière de couverture et retournez la glissière à l’envers. Analysez la motilité de nage par microscopie optique à l’aide d’un microscope optique, puis transférez trois microlitres de la culture au centre d’une plaque de gélose molle.

Incuber la plaque face vers le haut pendant la nuit entre 25 et 30 degrés Celsius. À l’aide d’une règle à la fin de l’incubation, mesurez la migration bactérienne du centre de la plaque vers la périphérie à travers la gélose. Culture Aeromonas souches pendant la nuit dans 900 millilitres TSB entre 25 et 30 degrés Celsius.

Après centrifugation, suspendre la pastille dans 20 millilitres de 100 millimolaires de chlorure d’hydrogène Tris tampon de pH 7,8. Pour retirer les flagelles ancrés, trempez la suspension dans un vortex avec une barre de verre pendant trois à quatre minutes, puis passez de manière répétitive à travers une seringue de calibre 21. Abattez les bactéries par deux centrifugations consécutives à quatre degrés Celsius et recueillez le surnageant dans un tube séparé.

Après ultracentrifugation du surnageant, suspendre la pastille dans 150 microlitres de chlorure d’hydrogène Tris de 100 millimolaires contenant deux millimolaires tampon EDTA. Transférer 150 microlitres de la fraction enrichie de flagelles dans un tube ultra clair à paroi mince et le remplir de 12 millilitres de solution de chlorure de césium. Ultracentrifugez le tube à 60 000 fois G pendant 48 heures à quatre degrés Celsius dans un rotor à godet oscillant.

Recueillir la bande flagellaire dans le gradient de chlorure de césium avec une seringue et dialyze contre 100 millimolaires chlorure d’hydrogène Tris plus deux millimolaires EDTA suivi d’une analyse par électrophorèse et coloration bleu de Coomassie ou spectrométrie de masse. Dans la figure suivante, la voie WT est Aeromonas piscicola AH3. Les voies un à huit montrent des colonies sensibles au chloramphénicol de la deuxième recombinaison.

ST est un marqueur hyper vésical de 1 Ko. Les voies un à trois et cinq à huit montrent les colonies avec le gène de type sauvage FGI4 comme voie WT. La quatrième voie montre une colonie avec le gène FGI4 supprimé. Les essais de microscopie optique ont montré que les modifications des flagelles polaires ou latéraux n’entraînent que des réductions des diamètres de migration, de sorte que les mutants AH-3 FGI et AH-3 FGI-4 ne montrent qu’une motilité réduite par rapport à la souche de type sauvage.

La figure montre le flagelle polaire de AH-3 de la première voie, et les mutants sans mutants dans la région FGI de la voie deux et le gène FGI-4 de la voie trois, dans lequel les deux mutants ont des flagellules polaires de poids moléculaire inférieur à celui de la souche de type sauvage, ce qui suggère des altérations du flagelle glycane. Il est important de s’assurer que les mutations n’affectent pas les gènes en aval et conduisent à l’incapacité de l’assemblage des flagelles ou à l’incapacité des filaments de flagelles. Lorsque les changements dans les protéines de flagelline ne sont pas détectables, une analyse par spectrométrie de masse est nécessaire en utilisant la protéine totale des peptides de flagelline afin de connaître la masse de glycane.