Les tests ACT1-CUP1 déterminent les sensibilités spécifiques au substrat des mutants splicéosomaux chez la levure bourgeonnante

Le test ACT1-CUP1 peut identifier si une mutation affecte l’épissage de l’ARN pré-messager et donner une indication de l’étape d’épissage la plus touchée. Le test ACT1-CUP1 établit un lien entre la mutation du facteur d’épissage et son impact sur le processus complexe d’épissage. Il utilise la lecture simple du phénotype de croissance et a une large plage de sensibilité.

Une utilisation efficace du temps est importante lors de la réalisation d’un test ACT1-CUP1. Commencez par un dosage de cinq à 10 souches pour minimiser les aberrations de croissance induites par le stress. Isabelle Marasigan, chercheuse de premier cycle de mon laboratoire, effectuerons la démonstration du processus.

Pour commencer, ajoutez 790 milligrammes de gélose et une barre à mélanger à chaque bouteille. Dans un grand bécher, préparez le milieu de croissance goutte de leucine pour toutes les plaques de cuivre à verser. Cela comprend 265 milligrammes de base d’azote de levure, 64 milligrammes de mélange de gouttes, moins la leucine et 34 millilitres d’eau désionisée pour chaque plaque à verser.

Remuer pour dissoudre Ensuite, ajoutez 34 millilitres de la solution de milieu de croissance goutte de leucine à chaque bouteille préparée de 100 millilitres et bouchez avec du papier d’aluminium. Ensuite, autoclave pour stériliser et dissoudre l’agar, en utilisant le cycle liquide recommandé pour l’autoclave. Le plus rapidement possible après l’autoclavage, ajoutez quatre millilitres de glucose à 20% dans chaque bouteille.

Ensuite, faites correspondre l’étiquette du tube à l’étiquette de la bouteille pour ajouter les deux millilitres de sulfate de cuivre chacune à sa bouteille prévue. À l’aide d’une plaque d’agitation, mélanger pendant environ 30 secondes et verser ou pipeter 35 millilitres dans la plaque étiquetée, en évitant les bulles. Par souche de levure, ajoutez neuf millilitres de milieu de croissance de goutte de leucine et un millilitre de glucose à 20% dans un tube conique stérile de 50 millilitres.

À l’aide d’un bâtonnet stérile ou d’une pointe de pipette, recueillir un petit échantillon de levure et inoculer le support. Ensuite, secouez toutes les cultures pendant la nuit à 180 tr / min et 30 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de culture à une cuvette, contenant 900 microlitres d’eau par souche.

Ensuite, mesurez la densité optique avec un spectrophotomètre et calculez la dilution requise pour être à une densité optique de 0,5 dans un volume final de deux millilitres. Ensuite, diluez chaque souche à une densité optique de 0,5 dans 10% de glycérol et remesurez la densité optique pour confirmer que la densité cellulaire se situe dans la plage souhaitée. Après avoir installé un lieu de travail stérile, allumez un brûleur Bunsen.

Pour un réplicateur à 48 broches, pipeter 200 microlitres de chaque souche diluée dans un puits séparé d’une plaque de 96 puits, et remplir les espaces vides dans la grille six par huit avec 200 microlitres de glycérol à 10%. Ensuite, trempez le réplicateur dans un plat peu profond d’éthanol à 95% et flamme pour stériliser. Laissez-le refroidir pendant au moins deux minutes après l’extinction de la flamme pour éviter que la chaleur ne choque les cellules.

Placez quatre plaques près du brûleur et retirez les couvercles. Trempez le réplicateur dans la plaque de 96 puits et soulevez-le d’un mouvement rapide. Ensuite, placez doucement sur la plaque et balancez légèrement d’avant en arrière pour faciliter un bon transfert.

Soulevez en un mouvement rapide et placez exactement dans la même orientation dans la plaque de 96 puits. Une fois qu’une assiette a été plaquée, déplacez-vous d’un mouvement doux sur le côté, mais toujours dans le parapluie de stérilisation de la flamme. Laissez les assiettes sécher complètement avant de placer les couvercles, généralement trois à cinq minutes.

Ensuite, incuber les assiettes pendant trois jours à 30 degrés Celsius. Après avoir retiré les plaques de l’incubateur, inspectez-les visuellement. L’essai de croissance a démontré qu’à mesure que la concentration de cuivre augmente, les souches avec un épissage plus faible montrent une confluence réduite, au point où la concentration de cuivre devient mortelle.

Le fond de levure comprend un gène ADE2 perturbé, ce qui fait que les colonies sont différentes nuances de rouge. Et les colonies matures étaient de couleur rouge foncé. Lors du placage, si le réplicateur est soulevé en se déplaçant à gauche ou à droite, amené à un angle, ou s’il est secoué au-dessus de la plaque, il est possible de créer des colonies de forme ovale, ou des microcolonies à partir de petites gouttelettes de solution cellulaire.

La levure avec le rapporteur A3c a survécu jusqu’à 0,15 millimolaire de cuivre tandis que les cellules rapporteures de type sauvage ont maintenu leur viabilité jusqu’à la fin de la plage de concentrations de cuivre testées. Les résultats de l’essai ont montré que les différentes bases à la position 57 de l’ARNn U6 ont des impacts uniques sur le splicéosome en combinaison avec une mutation du site premier 5, ou site de branchement. Alors que U57c est une mutation additive, diminuant la tolérance au cuivre, en combinaison avec A3c et les rapporteurs de sites de succursale G.

En revanche, U57a augmente la tolérance au cuivre car il favorise la progression vers la deuxième étape. Une fois que la perturbation de l’épissage est identifiée par ACT1-CUP1, la recherche peut passer à des méthodes plus quantitatives, comme l’extension de l’amorce et l’identification de l’interaction moléculaire perturbée par les EMSA et le sondage enzymatique. ACT1-CUP1 a été un test fondamental, renforçant notre compréhension de la robustesse et de la sélectivité du splicéosome de levure.

Et il continue d’élargir notre compréhension de la fonction splicéosomale.