Name: Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez une méthode robuste pour la production de masse de conidies infectantes de Metarhizium robertsii et M. pinghaense. Ce protocole optimise le rendement conidial pour la lutte biologique contre les ravageurs agricoles.

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Les auteurs tiennent à remercier Hort Pome, Hort Stone et le programme Technologie et ressources humaines pour l’industrie (THRIP: TP14062571871) pour le financement du projet.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Source des souches fongiques
<ol><li>Utiliser des souches fongiques isolées sud-africaines de M. pinghaense 5 HEID (numéro d’acquisition GenBank : MT367414/MT895630) et M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), collectées dans des vergers de pommiers de la province du Cap-Occidental, en Afrique du Sud.</li>
	<li>Cultiver des cultures de chaque isolat d’EPF sur 60 g de milieu de gélose au dextrose Sabouraud, complété par 1 g d’extrait de levure (SDAY) et 10 μL de streptomycine. REMARQUE: Incuber des cultures EPF à une température contrôlée de ± 25 ° C dans l’obscurité.</li>
</ol>2. Metarhizium pinghaense  et M. robertsii inoculation en suspension conidiale
<ol><li>Préparation des substrats solides<ol>
<li>Utiliser deux produits agricoles, à savoir l’avoine en flocons et l’orge en flocons, comme milieux de croissance pour les deux isolats d’EPF et les sacs d’autoclave (305 mm × 660 mm) comme sacs de fermentation.</li>
		<li>Utilisez un petit tuyau de déchets de polychlorure de vinyle (1000 mm × 50 mm) pour créer un goulot pour le sac de fermentation à l’extrémité ouverte du sac autoclave et utilisez du ruban adhésif pour fixer le tuyau au sac.</li>
		<li>Fermez le tuyau avec un bouchon de coton stérile pour permettre un échange de gaz suffisant pendant la fermentation.</li>
		<li>Peser les grains secs (200 g) de l’avoine en flocons et de l’orge en flocons et les placer dans les sacs de fermentation, et à chaque sac, ajouter 100 ml d’eau distillée et bien mélanger le contenu des sacs.</li>
		<li>Laissez reposer les grains humides pendant 15 à 30 minutes pour absorber l’humidité avant l’autoclavage et la stérilisation. Préparez six sacs pour chaque type de grain et, pour éviter toute contamination, placez les sacs dans d’autres sacs autoclaves et autoclavez les substrats à 121 °C pendant 55 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de l’inoculum de suspension conidiale<ol>
<li>Récoltez des conidies fongiques âgées de 2 à 3 semaines à partir de cultures fongiques de M. pinghaense et de M. robertsii en les grattant à l’aide d’une lame chirurgicale stérile.</li>
		<li>Suspendre les conidies fongiques collectées dans 20 mL d’eau distillée stérile, complétée par 0,05% Tween 20, et mélanger les suspensions conidiales en vortex pendant 2 min.</li>
		<li>Préparer 20 mL de suspensions conidiales, avec une concentration de 1 × 107 conidies/mL, et inoculer les substrats solides d’avoine en flocons et d’orge en flocons, respectivement. REMARQUE: Utilisez un hémocytomètre pour déterminer les concentrations conidiales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculation des substrats solides<ol>
<li>Ouvrez chaque sac en retirant les bouchons de col en coton et ajoutez la suspension cidiale préparée de 20 mL au substrat autoclavé refroidi.</li>
		<li>Refermez les sacs à l’aide des bouchons de cou et massez le contenu du sac pour permettre à l’inoculum fongique de se mélanger uniformément au substrat de grain.</li>
		<li>Incuber les sacs de fermentation à une température contrôlée de ± 25 °C et assurer un échange gazeux suffisant entre la culture et l’environnement. REMARQUE: Cette procédure doit être effectuée sous une armoire à flux laminaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Phase de fermentation<ol>
<li>Massez manuellement les substrats de grain dans les sacs de fermentation 2 jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible se produit et que le substrat a commencé à être agglutiné par le champignon en croissance. REMARQUE: Ceci est fait pour mélanger les granules inoculés afin de permettre la ramification mycélienne au cours des premiers stades de la croissance végétative des champignons.</li>
		<li>Utilisez un rouleau à pâtisserie de cuisine pour manipuler le lit du substrat afin d’éviter l’hétérogénéité physique des lits de substrat de grain et l’épaisseur du lit de la masse du substrat. REMARQUE: Le processus favorise le métabolisme fongique, ce qui optimise la production de spores fongiques et maximise la surface, favorisant le rendement conique18.</li>
		<li>Laissez le processus de fermentation se poursuivre jusqu’à 4-5 semaines et vérifiez les sacs de fermentation tous les 2 jours pour la présence de toute prolifération végétative blanche qui peut se développer pendant le processus de fermentation, ce qui peut grandement affecter le rendement des conidies fongiques. REMARQUE: Terminez immédiatement la fermentation dans les sacs de fermentation contenant toute prolifération végétative blanche et séchez les cultures fongiques18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inoculation de blastospore
<ol><li>Production et inoculation de blastospores<ol>
<li>Préparer un milieu de culture liquide contenant 1 L d’eau distillée, 30 g de glucose, 20 g d’extrait de levure, 4 g de phosphate de potassium diabasique (K2HPO4), 15 mL de liqueur de maïs et 10 μg/mL de l’antibiotique streptomycine, pour le M. pinghaense et le M. robertsii.</li>
		<li>Tout d’abord, chauffez l’eau distillée, éteignez-la avant d’atteindre le point d’ébullition et ajoutez chacun des ingrédients, à l’exception de la streptomycine, à l’eau chaude dans la casserole. Porter le milieu à ébullition douce pendant 3-4 min, et remuer constamment le milieu pour permettre le bon mélange des ingrédients et empêcher la sédimentation de certains des ingrédients au fond de la casserole.</li>
		<li>Versez un total de 100 mL du milieu dans neuf flacons différents de 250 mL et placez un bouchon de coton sur chaque flacon et recouvrez le coton avec du papier d’aluminium comme bouchon (Figure 1A).</li>
		<li>Autoclaver le milieu dans les flacons pendant 55 min à 121 °C. Après l’autoclavage, laisser refroidir le milieu dans les flacons et ajouter 10 mg/mL de streptomycine au milieu dans chaque flacon (figure 1B).</li>
		<li>Recueillir deux à trois boucles bactériennes de conidies fongiques dans des plaques de culture fongiques vieilles de 2 à 3 semaines pour les isolats d’EPF, M. pinghaense et M. robertsii, et transférer dans chaque milieu liquide de 100 mL dans les flacons de 250 ml, dans des conditions stériles, et sceller les flacons.</li>
		<li>Incuber les flacons de culture liquide à ± 25 °C, sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 3 jours, et cesser l’incubation une fois que les cultures montrent des signes de turbidité élevée avec croissance fongique des blastospores (Figure 1C).</li>
		<li>Pour détecter toute contamination bactérienne possible des cultures, prélever un échantillon de 100 μL dans chaque fiole de culture liquide après 24 h pendant l’incubation et plaquer sur trois plaques SDA par isolat. Incuber les plaques pendant 48 h, à une température contrôlée de ± 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du substrat solide<ol>
<li>Utilisez du riz blanc étuvé à grains longs comme substrat solide pour les blastospores de M. pinghaense et de M. robertsii (adapté de Jaronski et Jackson18).</li>
		<li>Préparer les sachets de fermentation comme indiqué ci-dessus, aux étapes 2.1.1-2.1.3, et pour chaque sac, ajouter 1 kg de riz et 300 ml d’eau distillée stérile.</li>
		<li>Mélanger doucement le contenu des sacs de fermentation et placer dans des sacs d’autoclave extérieurs en position verticale, et autoclaver à 121 °C pendant 55 min. Après l’autoclavage, laissez refroidir les substrats pendant ± 45 minutes dans des conditions stériles.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculation et fermentation<ol>
<li>Retirer la fermeture de chacune des fioles de culture liquide de M. pinghaense et de M. robertsii sous un écoulement laminaire et enflammer le bord de chaque fiole pendant 10 s.</li>
		<li>Versez les cultures liquides de 100 ml dans les sacs de fermentation en retirant les bouchons de coton de leur cou (Figure 2). Replacez les bouchons de coton et couvrez le haut du cou du sac avec du papier chirurgical fixé avec un élastique. REMARQUE: Déterminer la concentration de blastospores pour chaque flacon à l’aide d’un hémocytomètre et utiliser des concentrations de blastospores de 1 × 107 - 5 × 108 blastospores / mL pour inoculer les substrats28.</li>
		<li>Tordre la partie supérieure du sac et mélanger le contenu du sac en secouant et en manipulant légèrement le substrat par massage, et incuber les sacs à ± 25 °C, en aplatissant le substrat dans les sacs pour éviter la formation de lits épais18.</li>
		<li>Casser le substrat dans les sacs de fermentation en massant le contenu des sacs, 2-3 jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible et la liaison du substrat par le champignon s’étaient produites (adapté de la technique de Jaronski et Jackson18). REMARQUE: Laissez la fermentation se poursuivre pendant 4 semaines.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig01.jpg"> Figure 1: Milieu de culture liquide dans des flacons de 250 mL. (A) Avant autoclavage. (B) Après autoclavage et inoculation avec des spores d’EPF. (C) Milieu trouble avec blastospores fongiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig02.jpg"> Figure 2 : Milieu de culture liquide blastospore préparé. (A) Metarhizium robertsii et (B) Metarhizium pinghaense avant l’inoculation du riz comme substrat solide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Séchage des cultures fongiques
<ol><li>Sécher les cultures fongiques pendant 10 à 12 jours après la fermentation, avant leur utilisation dans des essais, en transférant les cultures sporulées dans des sacs en papier brun de 26 à 30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).</li>
	<li>Pour améliorer la résistance à la traction des sacs en papier, coupez horizontalement un tiers de la partie supérieure de chaque sac et tapissez le fond du sac (Figure 3A, B).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig03.jpg"> Figure 3: Préparation des sacs en papier, procédure de séchage des cultures et emballage. (A,B) Préparation des sacs en papier brun. La procédure de séchage des cultures d’espèces de Metarhizium cultivées sur du riz étuvé (C, E) et de l’orge en flocons (D, F). (G) Sacs en papier fermés avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="3"><li>Émietter doucement le substrat dans chaque sac de fermentation, couper le coin de chaque sac et transférer toute la culture dans les sacs en papier à travers l’espace laissé par le coin de coupure (Figure 3C-F). Pour éviter l’échappement excessif de spores fongiques dans l’air, effectuez ce processus lentement. REMARQUE: Effectuez ce processus dans des conditions stériles, en utilisant un flux laminaire, pour éviter la contamination.</li>
	<li>Étiquetez chaque sac en papier et pliez-le sur l’extrémité supérieure de chaque sac deux fois et fermez-les avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire, et placez les sacs sur des supports de séchage en fil pour permettre un séchage correct, uniforme, à une température contrôlée de ± 25 ° C et une faible humidité de 30 à 40%.</li>
	<li>Tournez les sacs tous les jours pour permettre un séchage uniforme des cultures et pour éviter toute repousse végétative qui pourrait avoir lieu, ce qui réduirait le rendement en spores fongiques récoltables.</li>
	<li>Peser chaque sac de séchage tous les 2 jours pendant le processus de séchage et poursuivre le processus de séchage pour chaque sac jusqu’à ce que peu ou pas de changement soit observé dans la masse des sacs entre les jours successifs.</li>
</ol>5. Récolte de conidies fongiques
<ol><li>Récolter mécaniquement les conidies fongiques des cultures à l’aide de trois tamis imbriqués, un tamis d’essai (ETS) maille n° 35 (avec une ouverture de 500 μm), imbriqué sur un tamis d’essai (avec une ouverture de 212 μm), imbriqué sur un maillage ETS n° 100 (avec une ouverture de 150 μm), monté sur un bac de collecte.</li>
	<li>Chargez lentement l’échantillon de culture sèche sur le tamis à mailles ETS n° 35 et placez un couvercle sur le tamis pour éviter la libération de conidies fongiques dans l’air.</li>
	<li>Ajouter 10 à 12 billes de verre aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis à mailles et éviter la rétention des conidies dans le tamis, ce qui peut réduire la récupération des spores.</li>
	<li>Scotchez et scellez les joints du tamis à l’aide de ruban électrique pour empêcher la fuite de poussière condescendante.</li>
	<li>Placez les tamis sur un agitateur vibrant, muni d’un tampon collant, pour fixer le bac de collecte et les tamis, pendant 20 à 25 minutes, à un mouvement de 560 à 640 vibrations par minute (Figure 4). NOTE: Technique adaptée de Jaronski et Jackson18.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig04.jpg"> Figure 4 : Récolte de spores fongiques provenant de cultures séchées de Metarhizium robertsii sur du riz et de l’orge en flocons. (A) 10 à 12 billes de verre ajoutées aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis maillés. Les conidies de M. robertsii récoltées dans les cultures sur (B) le riz et (C) s’écaillaient à peine. (D) Tamis sur un agitateur vibratoire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="6"><li>Retirez les tamis d’essai du bac de collecte, collectez les conidies et conservez les conidies collectées dans des sacs à fermeture à glissière étanches à l’air et imperméables à l’eau pour un stockage à long terme (3 à 6 mois).</li>
</ol>6. Quantification des conidies fongiques produites
<ol><li>Mesurer et enregistrer la masse de chaque substrat de grain avant la récolte des conidies fongiques de chaque substrat.</li>
	<li>Mesurer le poids total des conidies collectées en soustrayant la masse des spores collectées de la masse du substrat solide. REMARQUE: Le rendement total des conidies implique non seulement les conidies récoltées, mais aussi les conidies fongiques laissées sur le substrat solide.</li>
	<li>Peser le substrat et retirer 10 g du substrat pesé. Suspendre les 10 g du substrat dans 0,05% Tween 20 et diluer dans 10 mL d’eau distillée stérile.</li>
	<li>Mélangez la suspension en vortex pendant 2 min et utilisez un hémocytomètre pour faire le comptage des spores afin de déterminer le nombre de conidies lavées du substrat.</li>
	<li>Effectuer d’autres dilutions en transférant 1000 μL de la suspension conidiale lavée de 10 mL à 9 mL d’eau distillée stérile pour constituer 10 mL de suspensions de dilution.</li>
	<li>Mélange vortex les suspensions conidiales pendant 2 min et détermine les concentrations conidiales. REMARQUE: Suivez la procédure et la formule décrites par Inglis, Enkerli et Goettel30 pour déterminer la concentration conidiale des suspensions.</li>
	<li>Recueillir et suspendre un total de 0,1 g de la poudre cidiale recueillie de chaque culture dans 10 mL d’eau distillée stérile complétée par 0,05 % de Tween 20, et mélanger la suspension conique pendant 2 min, et déterminer la concentration cidiale à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Effectuer d’autres dilutions en transférant 1000 μL de la suspension conidiale de 10 mL à 9 mL d’eau distillée stérile pour constituer les dilutions de suspension de 10 mL.</li>
	<li>Vortex-mélanger les suspensions conidiales pendant 2 min, calculer les concentrations conidiales et déterminer le nombre de conidies par gramme.</li>
	<li>Multipliez le nombre de conidies par gramme de poudre récoltée par la masse initiale de la poudre conidiale récoltée. Multipliez le nombre de conidies lavées du substrat par le poids total du substrat usé, c’est-à-dire le substrat à partir duquel les conidies ont été récoltées.</li>
	<li>Additionnez les deux valeurs données et divisez par le poids sec initial du substrat pour calculer le nombre de conidies par kg ou g du substrat18. NOTE: Les calculs ont été effectués principalement pour le substrat de riz. L’essai de germination ou de viabilité conidiale a été effectué pour les isolats de M. pinghaense et de M. robertsii afin de déterminer la viabilité des conidies produites.</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Utiliser un logiciel informatique approprié pour effectuer l’analyse statistique des résultats obtenus. REMARQUE : L’analyse statistique des données a été effectuée à l’aide de statistica version 13.5.0.17.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’intégration réussie d’agents microbiens pour la lutte biologique contre d’importants insectes nuisibles agricoles dans un agroécosystème dépend à la fois du succès et de la facilité de production de masse des entomopathogènes comme première étape dans des conditions de laboratoire. La production en série d’EPF est importante pour l’application à grande échelle et la disponibilité des produits EPF pour les programmes de lutte intégrée utilisant la lutte biologique</su...

Les champignons entomopathogènes (FPE) ont gagné en importance en tant qu’agents de protection des cultures dans la lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles importants 1,2. Les entomopathogènes, qui se produisent naturellement dans le sol, provoquent des épizooties dans les populations de diverses espèces de ravageurs3. Les espèces de FPE sont spécifiques à l’hôte et présentent relativement peu de risques en termes d’attaque d’espèces non ciblées, et elles ne sont pas toxiques pour l’environnement4. Les FPE ont un mécanisme unique pour envahir leur hôte, ainsi que pour se propager et persister dans leur environnement immédiat1. Ils attaquent l’hôte principalement par le biais de spores asexuées qui s’attachent et pénètrent dans la cuticule de l’hôte pour envahir et proliférer dans l’hémocène hôte. L’hôte finit par mourir en raison de l’épuisement des nutriments de l’hémolymphe ou à la suite de la toxémie causée par les métabolites toxiques libérés par le champignon. Après la mort, dans des conditions environnementales idéales, le champignon émerge sur la surface externe (mycose manifeste) du cadavre hôte 5,6.
Les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des résidus chimiques sur la santé humaine, la pollution de l’environnement et le développement de la résistance aux ravageurs ont conduit à la campagne mondiale visant à réduire les apports d’insecticides à base de produits chimiques et à trouver des stratégies alternatives, nouvelles et durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire 6,7,8 . Cela a permis de mettre au point des insecticides à base de microbes à utiliser dans les programmes de lutte intégrée contre les ravageurs (LAI), qui sont des stratégies plus favorables sur le plan écologique que la lutte chimique conventionnelle 3,8.
Pour mettre au point un agent de lutte microbienne efficace pour un ravageur agricole, un organisme approprié doit d’abord être isolé, caractérisé, identifié et sa pathogénicité pour l’organisme nuisible cible confirmée. Cependant, une méthode simple et rentable pour la production à grande échelle de l’agent microbien est nécessaire pour produire un produit viable destiné à être utilisé dans les programmes de lutte biologique 9,10,11,12,13. La production en masse de quantités substantielles d’entomopathogènes de bonne qualité dépend de la souche microbienne, de l’environnement, du ravageur cible, de la formulation, du marché, de la stratégie d’application et du produit final souhaité 14,15,16. L’EPF peut être produit en série en utilisant la fermentation de substrat liquide pour produire des blastospores ou le processus de fermentation de substrat solide pour produire des conidiesaériennes 6,17,18. Cependant, le processus de production et de formulation en masse des entomopathogènes influence directement la virulence, le coût, la durée de conservation et l’efficacité sur le terrain du produit final. Pour une utilisation réussie dans la lutte intégrée, le processus de production des entomopathogènes doit être facile à exécuter, nécessiter un minimum de travail, produire une concentration à haut rendement de propagules virulentes, viables et persistantes et être peu coûteux 4,13,14,16.
Comprendre les besoins nutritionnels des entomopathogènes est important pour la culture de masse avec toutes les méthodes de culture 4,12. Les composants nutritionnels du milieu de production ont un impact significatif sur les attributs des propagules résultantes, y compris l’efficacité du biocontrôle, le rendement, la tolérance à la dessiccation et la persistance 8,19,20,21. L’optimisation des procédures de production est conçue pour répondre à ces facteurs22. Pour l’EPF, les principales exigences pour une bonne croissance, une sporulation et une production de masse de conidies fongiques sont une humidité adéquate, une température de croissance optimale, un pH, un échange gazeux de CO2 et d’O2 et une nutrition, y compris de bonnes sources de phosphore, de glucides, de carbone et d’azote18.
Jaronski et Jackson18 décrivent la méthode de fermentation du substrat solide comme la méthode d’approximation la plus efficace et la plus proche du processus naturel de production d’EPF par rapport à la méthode de fermentation du substrat liquide car, dans des conditions naturelles, le conidium fongique est porté sur des structures érigées solides, comme la surface des cadavres d’insectes. Les produits agricoles et les sous-produits contenant de l’amidon sont principalement utilisés pour la production de masse de champignons hypocréagènes, car les champignons décomposent facilement l’amidon par la sécrétion d’enzymes hydrolytiques hautement concentrées à partir de leurs extrémités hyphales, pour pénétrer dans la substance solide et pour accéder aux nutriments présents dans la substance 11,17,18,23 . Les produits céréaliers répondent également aux besoins d’une production saine de biomasse car, lorsqu’ils sont hydratés et stérilisés, les substrats peuvent absorber d’autres nutriments de tout milieu liquide 16,18,24.
Auparavant, plusieurs études ont tenté de cultiver en masse des espèces d’EPF comme Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas et une partie du Metarhizium anisopliae (Metschn.) Isolats complexes d’espèces de sorokine sur divers substrats 16,23,24. Ces isolats produits en série et développés commercialement comprennent Green Muscle® (souche IMI 330189), développé à partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (souche Meta 69 ICIPE69), et Real Metarhizium 69 (L9281), développé à partir de M. anisopliae, et Broadband® (souche PPRI 5339) et Eco-Bb®, développé à partir de B. bassiana25,26 . Cependant, des tentatives limitées ont été faites pour la culture de masse Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber et Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Ces deux isolats ont été sélectionnés dans une étude précédente comme les plus efficaces pour la lutte contre la cochenille, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Par conséquent, la présente étude visait à formuler et à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes des isolats locaux de M. robertsii et M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles. La méthode de fermentation du substrat solide a été utilisée pour produire en masse les conidies fongiques pour les deux isolats d’EPF. Deux méthodes d’inoculation EPF, utilisant des suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores, ont été utilisées pour inoculer les substrats solides.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Tween 20</td><td>Lasec</td><td></td><td>Ajouté aux suspensions conidiales pour permettre aux spores fongiques de se mélanger à l’eau</td></tr><tr><td>Bouteilles McCartney de 20 mL</td><td>Lasec</td><td></td><td>Utilisé pour fabriquer des suspensions conidiales</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium Utilisé</td><td></td><td></td><td>comme couverture des bouchons de coton sur un flacon de 250 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour stériliser les matériaux et les ingrédients utilisés pour la production des conidies process</td></tr><tr><td>Sacs d’autoclave</td><td>Lasec</td><td></td><td>Sacs de fermentation ou récipients à substrat solide</td></tr><tr><td>Ruban d’autoclave</td><td>Lasec</td><td></td><td>Pour fixer les tuyaux en PVC sur les sacs de fermentation</td></tr><tr><td>Sacs en papier kraft brun Utilisé</td><td></td><td></td><td>pour sécher les cultures de conidies sur les grains agricoles</td></tr><tr><td>Brûleur Bunsen</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>Utilisé pour flamber l’équipement (lames chirurgicales, boucles d’inoculation et bords de flacons)</td></tr><tr>Tamis <td></td><td></td><td>d’essai à bord transparent</td><td>Utilisé pour séparer les conidies fongiques des substrats de céréales agricoles</td></tr><tr><td>Liqueur de trempage de maïs</td><td>SIGMA</td><td>66071-94-1</td><td>Ingrédient du milieu liquide blastospore</td></tr><tr><td>Coton Laine</td><td>Lasec</td><td></td><td>Utilisé comme bouchon du cou pour les sacs de fermentation</td></tr><tr><td>Duran laboratoire bouteilles</td><td>Neolab</td><td></td><td>Utilisé pour autoclaver le milieu SDA et l’eau distillée</td></tr><tr><td>Ruban</td><td></td><td></td> électrique <td>Utilisé pour coller et sceller les joints du tamis afin d’empêcher la fuite de poussière conidique</td></tr><tr><td>Tamis</td><td></td><td></td> d’essai ENDECOTTS <td>Utilisé pour séparer les conidies fongiques des substrats de céréales agricoles</td></tr><tr><td>Erlenmeyer Fioles à col étroit, flacon de 250 mL</td><td>Lasec</td><td></td><td>Support du milieu liquide blastospore</td></tr><tr><td>Éthanol (99 %)</td><td>Lasec</td><td></td><td>Utilisé pour stériliser les lames chirurgicales et les anses d’inoculation</td></tr><tr><td>Orge en flocons</td><td>Health Connection Wholefoods Grain</td><td></td><td>agricole utilisé comme substrat solide pour la croissance des conidies de M. pinghaense et M. robertsii</td></tr><tr><td>Avoine en flocons</td><td>Marques</td><td></td> <td>TigerGrain agricole utilisé comme substrat solide Milieu de croissance pour les conidies de M. pinghaense et M. robertsii</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td></td><td>Ingrédient du milieu liquide de blastospores</td></tr><tr><td>Chambre de croissance/ incubateurs</td><td></td><td></td><td>Pour la culture de conidies fongiques en croissance</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour déterminer les concentrations</td></tr> <tr><td>de conidiesBoucles d’inoculation</td><td>Lasec</td><td></td><td>Pour la récolte des spores afin d’inoculer le milieu liquide pour la croissance des blastospores</td></tr><tr><td>Rouleau</td><td></td><td></td> à pâtisserie de cuisine <td>Utilisé pour manipuler le lit de substrat à grains solides</td></tr><tr><td>Armoire à flux laminaire</td><td>ESCO Armoire</td><td></td> à flux laminaire <td>Fournir un environnement stérile pendant l’inoculation du substrat</td></tr> <tr><td>Metarhizium pinghaense conidia</td><td>Stellenbosch Université</td><td>5HEID</td><td>Cultures utilisées pour la culture de masse des conidies de Metarhizium pinghaense</td></tr><tr><td>Metarhizium robertsii Conidia</td><td>Université de Stellenbosch</td><td>6EIKEN</td><td>Cultures utilisées pour la culture de masse des conidies de Metarhizium robertsii</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEIZZ (Scope. A1)</td><td></td><td>Utilisé pour déterminer les concentrations de conides et la viabilité des conidiales</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>IncoShake- LABOTEC</td><td></td><td>Utilisé pour le processus de production de blastospores</td></tr><tr><td>Riz étuvé</td><td>Spekko</td><td></td><td>Grain agricole utilisé comme substrat solide pour les conidies de M. pinghaense et M. robertsii</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Ajouté au milieu SDA pour éviter la contamination bactérienne</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Lasec</td><td></td><td>Récipients pour le milieu SDA</td></tr><tr><td>Pipettes et pointes de pipette</td><td>Labnet (BioPette PLUS)</td><td></td><td>Utilisé pour mesurer les ingrédients liquides</td></tr><tr><td>Tuyau de vidange en polychlorure de vinyle Marley Utilisé</td><td></td><td></td><td>pour créer un goulot pour le sac de fermentation</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Ingrédient du milieu liquide blastospore</td></tr><tr><td>Élastique</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour fixer le papier chirurgical sur le sac de fermentation Cols de tuyau en PVC Gélose</td></tr><tr><td>au dextrose Sabaroud (SDA)</td>Milieu <td></td> de <td>culture NEOGEN</td><td>Milieu utilisé pour la culture des spores de Metarhizium pinghaense et Metarhizium robertsii</td></tr><tr><td>Eau</td> <td>distillée stérile</td><td></td><td>Pour hydrater les grains agricoles, pour fabriquer des suspensions conidiales</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> collant <td>Utilisé pour sécuriser les saisies sur le vibrateur</td></tr><tr><td>Lame chirurgicale</td><td>Lasec</td><td></td><td>Utilisé pour gratter les spores des cultures fongiques</td></tr><tr><td>Papier chirurgical</td><td>Lasec</td><td></td><td>Utilisé pour couvrir les cols en PVC et les bouchons de coton du sac de fermentation</td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td> <td>vibrantUtilisé pour secouer les conidies des substrats de céréales agricoles</td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>Utilisé pour mélanger des suspensions de conidiales dans des bouteilles Mc Cartney</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Biolab</td><td></td><td>Ajouté au milieu SDA pour améliorer la germination et la croissance des spores</td></tr><tr><td>Sacs à fermeture éclair</td><td>GLAD</td><td></td><td>Utilisé pour stocker les conidies fongiques récoltées</td></tr></tbody></table>

production de masse de champignons entomopathogènes, metarhizium robertsii et metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Les champignons entomopathogènes du complexe d’espèces Metarhizium anisopliae ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. L’augmentation de la résistance des ravageurs aux insecticides chimiques, les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des insecticides sur la santé humaine et la pollution de l’environnement par les pesticides ont conduit à une campagne mondiale pour trouver de nouvelles stratégies durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire. Auparavant, des tentatives de culture de masse d’espèces de champignons entomopathogènes (EPF) telles que Beauveria bassiana ont été menées. Cependant, seules des tentatives limitées ont été menées pour la culture de masse Metarhizium robertsii et M. pinghaense pour une utilisation contre les insectes nuisibles. Cette étude visait à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de M. robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale. Trois produits céréaliers agricoles, l’avoine en flocons, l’orge en flocons et le riz, ont été utilisés comme substrats de fermentation solide epf. Deux méthodes d’inoculation, les suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores ont été utilisées pour inoculer les substrats solides. L’inoculation à l’aide de suspensions conidiales s’est avérée relativement moins efficace, car des niveaux accrus de contamination ont été observés sur les substrats solides par rapport à l’utilisation de la méthode d’inoculation blastospore. L’avoine en flocons n’a pas été un substrat de croissance approprié pour M. robertsii et M. pinghaense, car aucune conidie sèche n’a été récoltée à partir du substrat. Il a été constaté que l’orge en flocons favorisait la production de conidies M. robertsii par rapport à celle de M. pinghaense, et une moyenne de 1,83 g ± 1,47 g de conidies sèches de M. robertsii et zéro gramme de conidies M. pinghaense ont été récoltés sur le substrat. Il a été constaté que les grains de riz favorisaient la production de masse conidiale d’isolats de M. pinghaense et de M. robertsii , avec une moyenne de 8,2 g ± 4,38 g et 6 g ± 2 g récoltés sur le substrat, respectivement.

Une diminution de la masse de teneur des cultures sur le riz pour le M. pinghaense et le M. robertsii a été observée au fil du temps pendant la phase de séchage des cultures fongiques, sans ou peu de changement observé dans la masse une fois les cultures sèches (figure 5). La poudre de conidies fongiques sèches récoltées du M. pinghaense et du M. robertsii est illustrée à la figure 6.
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Les champignons entomopathogènes ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. Dans cette étude, la production en masse d’un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de Metarhizium robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles a été menée avec succès en utilisant des produits céréaliers agricoles.

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Cette méthode fournit de nouvelles informations sur la façon de produire en masse des conidies infectieuses de champignons entomopathogènes pour lutter contre les insectes nuisibles importants dans les agro-écosystèmes commerciaux, compte tenu de la situation actuelle où la plupart des insecticides sont progressivement éliminés en raison de préoccupations concernant leur effet toxique sur l’environnement et la santé humaine. La technique décrit la méthode utilisée pour assurer le rendement optimal des conidies EPF lors de la production de masse. La méthode est utile pour la lutte intégrée contre les ravageurs et la lutte biologique en fournissant un aperçu de l’efficacité des conidies produites en masse pour la gestion à grande échelle des insectes nuisibles résistants aux insecticides nuisibles dans les agro-écosystèmes.Cette procédure a été développée et démontrée par le Dr Letodi Luki Mathulwe, le Dr Nomakholwa Faith Stokwe et le professeur Antoinette Paula Malan. Chauffez un litre d’eau distillée et éteignez le feu avant d’atteindre le point d’ébullition. Maintenant, ajoutez 30 grammes de glucose, quatre grammes de phosphate de potassium dibasique, 20 grammes d’extrait de levur

mass-production-entomopathogenic-fungi-metarhizium-robertsii

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Ici, nous signalons les différentes étapes impliquées dans le développement fondé sur la connaissance d'un mycoinsecticide efficace, y compris l'isolement, l'identification, le dépistage et la sélection du champignon entomopathogène "meilleur ajustement", Metarhizium anisopliae , pour le contrôle des insectes nuisibles en agriculture .

Développement de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; En tant que myco-insecticide: de l&#39;isolement au rendement sur le terrain

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des champignons entomopathogènes à partir d’un foreur de bois forestier et une manière substitutive d’évaluer leurs activités entomopathogènes à l’aide d’un insecte modèle coléoptère. Cette méthode est efficace et pratique pour explorer les ressources fongiques entomopathogènes des insectes xylophages ravageurs dans les forêts naturelles.

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Nous présentons deux méthodes permettant aux agriculteurs de propager massivement des nématodes entomopathogènes sous forme de bioinsecticides. La première méthode utilise le gel de polyacrylamide comme substrat de culture du nématode, tandis que la seconde utilise du coton recouvert de polymère comme substrat de culture. Les deux méthodes reposent sur la propagation in vivo des nématodes à l’intérieur des cadavres d’insectes.

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Kindlins sont fondamentales pour l'adhésion cellulaire intégrines mais les études d'entre eux ont été entravés par la difficulté rencontrée dans leur expression par recombinaison dans des hôtes bactériens. Nous décrivons ici des procédés pour leur production efficace dans des cellules d'insecte infectées par un baculovirus.

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CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Découvrez une méthode robuste pour la production de masse de conidies infectantes de Metarhizium robertsii et M. pinghaense. Ce protocole optimise le rendement conidial pour la lutte biologique contre les ravageurs agricoles.

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles (Vidéo) | JoVE Journal

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

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