Name: Modélisation de la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Découvrez une méthode reproductible pour évaluer la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro. Ce protocole permet d'étudier les effets de Wnt5a sur les cellules de la crête neurale et les myoblastes murins.

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Ce travail a été soutenu en partie par les prix F30HL154324 à O.T. et K08HL121191 et R03HL154301 à S.R.K. Les auteurs tiennent à reconnaître que le schéma de la figure 1 de ce manuscrit a été créé avec biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

La voie de signalisation non canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) est une voie de signalisation cellulaire d’une importance critique qui a été impliquée dans de multiples processus de développement 24,25 et de maladie24,26. Au cours du développement embryonnaire, la signalisation Wnt non canonique implique un vaste réseau de signaux moléculaires provenant de cellules émettrices de sig...

La signalisation Wnt non canonique est une voie conservée de manière évolutive qui régule l’organisation des filaments cellulaires et la migration directionnelle. Cette voie a été impliquée dans de multiples processus biologiques, y compris la morphogenèse des tissus embryonnaires 1,2,3, l’angiogenèse lymphatique et vasculaire 4,5,6,7, et la croissance du cancer et les métastases 8,9,10 . Au niveau cellulaire, la signalisation Wnt non canonique est réalisée par le biais d’interactions paracrines coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Ces interactions se produisent fréquemment entre des cellules de lignées ou de types différents et impliquent un réseau moléculaire diversifié qui comprend jusqu’à 19 ligands et plusieurs récepteurs, corécepteurs et effecteurs de transduction du signal en aval11. Pour compliquer davantage ce processus de signalisation, des études antérieures ont montré que les combinaisons ligand-récepteur peuvent varier d’une manière dépendante du contexte et des tissus 12,13, et que les mêmes ligands sources qui conduisent la signalisation Wnt non canonique dans les cellules réceptrices de signaux peuvent être produits par plusieurs types de cellules émettrices de signaux 14,15 . Compte tenu de la complexité cellulaire et moléculaire associée à la signalisation Wnt non canonique, la capacité d’étudier des mécanismes individuels et cliniquement pertinents in vivo a été limitée.
Des tentatives ont été faites pour étudier la signalisation Wnt non canonique en utilisant des techniques de culture cellulaire in vitro. Par exemple, des essais de cicatrisation effectués dans des monocouches cellulaires ont été utilisés pour évaluer fonctionnellement la migration directionnellecellulaire 4,16,17,18,19. Des techniques d’immunomarquage ont été utilisées pour effectuer des analyses spatiales de l’expression des protéines de surface afin d’évaluer les changements non canoniques induits par Wnt dans la morphologie cellulaire 7,10, l’architecture et la polarisation asymétrique18,19,20. Bien que ces approches aient fourni des outils importants pour caractériser les phénotypes liés au Wnt dans les cellules réceptrices de signaux, l’absence de composants d’envoi de signaux dans ces protocoles limite leur capacité à modéliser avec précision les mécanismes de signalisation paracrine observés in vivo. En conséquence, il reste un besoin critique de développer des systèmes in vitro qui permettent une évaluation robuste et reproductible des interactions de signalisation paracrine entre les cellules émettrices et réceptrices de la voie Wnt non canonique, en particulier celles de différents types de cellules.
À cette fin, l’objectif principal de cette étude était d’établir un protocole pour modéliser les interactions paracrines non canoniques de signalisation Wnt in vitro. Nous avons développé un système de coculture sans contact qui récapitule les composants d’envoi et de réception de signaux de ces interactions et permet l’utilisation d’approches moléculaires, génétiques ou pharmacologiques standard pour étudier indépendamment les mécanismes ligand-récepteur spécifiques dans la voie Wnt non canonique. Les mécanismes de signalisation Wnt médiée par NCC ont été examinés dans des myoblastes utilisant des lignées cellulaires murines établies. Comme preuve de principe, ce modèle a été utilisé pour corroborer les résultats d’études in vivo antérieures chez la souris qui impliquent l’axe Wnt5a-ROR2 comme voie de signalisation Wnt non canonique pertinente entre les NCC 21 et les progéniteurs de cardiomyoblastesSHF 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage anti-décoloration avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>C2C12 lignée cellulaire de myoblastes murins</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen (DMEM), glycémie élevée (4,5 g/L), L-glutamine (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques Falcon, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Support perméable Falcon pour plaque à 24 puits avec 0,4 & micro ; M membrane PET transparente</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Stocké dans des aliquotes de 50 mL à -20 &deg ; Solution</td></tr><tr><td>de gélatine C, 0,1 %</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pointes de pipette graduées et stériles, 10 & micro ; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), 106 unités/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimum (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles antiadhésives en verre automatique, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 Lignée cellulaire de crête neurale</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde solution dans PBS, 4 %</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 &mu ; g/mL de streptomycine)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Stocké dans des aliquotes de 10 mL à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Stocké à -20 &deg ; C, Tenir à l’abri de la lumière</td></tr><tr><td>Phosphate-tampon salin (PBS), 1x, sans calcium ni magnésium, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes humains recombinants-basique (rhFGF-basic)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Protéine Wnt5a recombinante humaine/souris</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium, 100</td><td>mM Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri carrée avec grille</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO cellules nourricières de fibroblastes murins</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 0,25</td> %<td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence Zeiss Apotome.2</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique Zeiss inversé Axio Vert.A1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 Logiciel de microscopie</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation de la signalisation wnt paracrine non canonique in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

La signalisation Wnt non canonique régule l’organisation intracellulaire du filament d’actine et la migration polarisée des cellules progénitrices au cours de l’embryogenèse. Ce processus nécessite des interactions paracrines complexes et coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Étant donné que ces interactions peuvent se produire entre différents types de cellules de différentes lignées, l’évaluation in vivo des défauts spécifiques aux cellules peut être difficile. La présente étude décrit une méthode hautement reproductible pour évaluer la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro. Ce protocole a été conçu avec la capacité de (1) mener des évaluations fonctionnelles et moléculaires de la signalisation Wnt non canonique entre deux types de cellules d’intérêt; (2) disséquer le rôle des molécules émettrices de signaux par rapport aux molécules réceptrices de signaux dans la voie de signalisation Wnt non canonique; et (3) effectuer des expériences de sauvetage phénotypique avec des approches moléculaires ou pharmacologiques standard.
Ce protocole a été utilisé pour évaluer la signalisation Wnt non canonique médiée par les cellules de la crête neurale (NCC) dans les myoblastes. La présence de NCC est associée à une augmentation du nombre de filopodies cytoplasmiques et de lamellipodes phalloïdines positives dans les myoblastes et à une amélioration de la migration des myoblastes dans un test de cicatrisation. L’axe Wnt5a-ROR2 a été identifié comme une voie de signalisation Wnt non canonique cruciale entre la NCC et les progéniteurs de cardiomyoblastes du deuxième champ cardiaque (SHF). En conclusion, il s’agit d’un protocole très facile à traiter pour étudier les mécanismes de signalisation Wnt paracrines non canoniques in vitro.

Effets des CCN sur la capacité migratoire des myoblastes murins Ce test a d’abord été appliqué pour évaluer l’impact des CCN sur la capacité migratoire des myoblastes. La figure 1 présente le modèle schématique de l’essai. Pour tester cet impact, des tests de grattage ont été effectués avec des myoblastes cultivés isolément (sans inserts NCC) par rapport à ceux cultivés en présence d’inserts. Comme témoin positif, 500 ng/mL de Wnt5a recombinant (rWnt5a) ont été ajoutés au...

La présente étude décrit une méthode hautement reproductible et traitable pour étudier in vitro les événements paracrines non canoniques de signalisation Wnt. Ce protocole a été appliqué pour évaluer l’impact de la signalisation paracrine Wnt5a dans les cellules de la crête neurale murine et les myoblastes.

Modélisation de la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Ce protocole décrit une méthode hautement reproductible pour évaluer fonctionnellement et moléculairement la signalisation Wnt paracrine non canonique dans toute population cellulaire d’intérêt. Les évaluations fonctionnelles et moléculaires sont effectuées dans la même population cellulaire et peuvent être appliquées à l’étude de n’importe quelle composante de la voie Wnt/PCP. Pour commencer, remettez en suspension la cellule C2C12 précédemment granulée dans 10 millilitres de milieu C2C12.Pour diluer les cellules dans un rapport de 1:20, ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant 9,5 millilitres de milieu C2C12 frais et mélangez doucement avec une pipette sérologique à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’un nouveau puits à quatre chambres et placez-le dans l’incubateur. Pour le placage des inserts de cellules O9-1, remettre en suspension la pastille de cellule O9-1 dans 10 millilitres de milieu de croissance O9-1. Et semblable à la dilution des cellules C2C12, diluez les cellules O9-1 dans un rapport de 1:20.Ensuite, placez un seul insert perméable à l’intérieur de chaque puits d’un nouveau puits à quatre chambres rempli d’un millilitre de milieu de croissance O9-1. Ajouter 300 microlitres de la suspension cellulaire O9-1 diluée à chaque insert et s’assurer que l’insert est complètement immergé. Incuber ensuite le puits à 37 degrés Celsius.Pour effectuer l’élimination du siRNA dans les cellules O9-1, diluer le siRNA et le réactif de transfection dans le milieu sérique réduit selon les recommandations du fabricant aux concentrations souhaitées. Mélanger délicatement le siRNA dilué et le réactif de transfection et incuber le mélange à température ambiante pendant sept minutes. Après 18 à 24 heures de placage cellulaire, ajouter les complexes lipidiques siRNA aux inserts cellulaires O9-1 et incuber pendant environ 34 à 48 heures.Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, retirez bien le milieu de la chambre C2C12 et lavez les cellules une fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, commencez à gratter les cellules en passant fermement une pointe de pipette P10 stérile dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire. Une fois les cellules rayées, ajoutez rapidement un millilitre de PBS.Ensuite, allumez l’ordinateur et le microscope. Placez la glissière de la chambre sur la scène et faites pivoter le cadran de l’objectif à un grossissement de 5X. Ouvrez le logiciel d’imagerie.Cliquez sur l’onglet de la caméra, puis sur le bouton En direct pour visualiser les cellules de l’onglet AxioCam IC. Assurez-vous que le filtre de lumière est complètement tiré pour permettre à la lumière de passer à l’écran de la caméra et de l’ordinateur, déplacez ou faites pivoter manuellement la glissière de la chambre pour positionner la zone enroulée au centre de l’image en direct sur l’onglet AxioCam IC. Pour prendre des images, cliquez sur Aligner pour ouvrir un nouvel onglet en regard de l’onglet AxioCam IC qui contient l’image.Pour enregistrer cette image fixe, cliquez sur le fichier, sélectionnez Enregistrer sous, sélectionnez Bureau dans la barre de gauche pour enregistrer le fichier sur le bureau, entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier et enregistrez la figure au format de fichier czi. Pour enregistrer l’image au format tiff, cliquez sur fichier, sélectionnez Enregistrer sous, entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier. Cliquez sur le bouton Type de fichier et sélectionnez tiff dans le menu déroulant.Repositionnez manuellement la lame de chambre pour prendre deux à trois images supplémentaires à d’autres points de la plaie dans le même puits. Après l’imagerie, retirez le PBS de chaque puits et ajoutez un millilitre de milieu C2C12. Assembler le système de coculture d’insertion de puits en plaçant manuellement les inserts contenant les cellules O9-1 dans chaque puits du puits de la chambre.Poussez doucement les inserts vers le bas dans le puits, de sorte que le fond de l’insert se trouve juste au-dessus des cellules C2C12 sous-jacentes. Retournez les constructions d’insertion de puits dans l’incubateur et laissez les cellules migrer pendant un total de neuf à 12 heures. Pour déterminer le temps de migration optimal, vérifiez les cellules six heures après la création de la plaie, puis toutes les deux à trois heures par la suite.Terminez l’expérience lorsque les cellules dans des conditions de contrôle couvrent complètement la plaie. Commencer la fin de l’essai de migration et la déconstruction du système d’insertion de puits en retirant les inserts de cellules O9-1 après neuf à 12 heures de la période de migration. Aspirer soigneusement le milieu C2C12.Ajoutez 0,5 millilitre de PBS aux puits de la chambre et prenez des images finales des cellules après la migration. Aspirez soigneusement tout le PBS mélangé avec du milieu et retirez les chambres en plastique des puits de la chambre en utilisant les instructions de la trousse. Quitter la lame sous-jacente contenant les cellules C2C12.Pour l’immunomarquage, incuber immédiatement la lame avec de l’aldéhyde paraforme à 4% pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le paraformaldéhyde et lavez la lame avec du Triton X-100 à 0,1% contenant du PBST pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, versez PBST et lavez la lame deux fois avec PBS pendant 10 minutes chacune.Ensuite, créez une limite hydrophobe avec un stylo hydrophobe autour de la lame pour empêcher les solutions de se répandre de la lame empêchant la perturbation des cellules d’adhérence. Ensuite, ajoutez environ 0,5 millilitre de solution bloquante à 1% BSA à la lame à l’intérieur de la limite hydrophobe et incuber la lame pendant une heure à température ambiante dans une chambre à lame humidifiée. À la fin de l’incubation, retirer la solution bloquante et ajouter l’anticorps phalloïdine à cette lame dans la limite hydrophobe, puis incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, placez la lame dans un support de diapositive protégé de l’exposition à la lumière. Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Ajoutez un support de montage contenant du DAPI, montez les lames avec des lames de couvercle en verre et capturez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence standard.Dans la présente étude, l’ajout de Wnt5a recombinant aux puits de co-culture a accéléré la migration des myoblastes avec une récupération complète de certaines zones en neuf heures. Dans les trois conditions, les myoblastes migrateurs présentaient une morphologie cellulaire migratoire normale, y compris des filopodies et des lamellipodes bien formés et saillants et une polarisation asymétrique des projections cytosquelettiques d’actine. L’effet paracrine de Wnt5a dérivé de NCC sur la migration des myoblastes a été étudié.Le traitement avec 50 nanomolaires siRNA contre Wnt5a a réduit l’expression du gène Wnt5a de 64% par rapport au contrôle négatif. La migration des explosions de milles C2C12 avec une réduction significative après l’élimination de Wnt5a dans les CCN et l’ajout de Wnt5a recombinant exogène ont sauvé ce déficit migratoire et ce défaut morphologique dans ces myoblastes. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires de réception du signal dans le modèle paracrine, le récepteur ROR2 a été renversé et l’expression génique a été réduite de 54%.Le Wnt5a recombinant exogène n’a pas réussi à sauver la migration des myoblastes après l’élimination de ROR2, ce qui suggère que la déplétion de ROR2 perturbe la capacité des myoblastes à recevoir des signaux Wnt5a. Cellules de culture à densité adéquate rayer avec pointe P10 une seule fois assembler et démonter le système de co-culture avec soin sans perturber la cellule sous-jacente. Cette technique a été utilisée comme preuve de concept pour étudier un axe de signalisation moléculaire spécifique dans la voie complexe Wnt / PCP avec une pertinence pour la biologie des cellules de la crête neurale et du deuxième champ cardiaque.

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