Utilisation de la coloration rouge Alizarin pour détecter la perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre
28 décembre 2021
Ici, nous avons utilisé la coloration rouge alizarine pour montrer que l’exposition à l’acétate de plomb provoque un changement de masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cette méthode de coloration peut être adaptée à l’étude de la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre induite par d’autres substances toxiques dangereuses.
Cette méthode peut aider à détecter la toxicité osseuse induite par les produits chimiques chez le poisson zèbre. La coloration rouge d’alizarine des tissus fixes génère un enregistrement permanent des changements squelettiques qui peuvent faciliter les comparaisons de plusieurs spécimens. Cette technique pourrait être utile pour étudier l’ostéoporose dans le modèle du poisson zèbre, car l’une des caractéristiques de l’ostéoporose est la diminution de la masse osseuse.
Retirer 10 larves de poisson zèbre au hasard de chaque groupe neuf jours après la fécondation et fixer le poisson dans un millilitre d’aldéhyde paraforme à 2% et 1X PBS pendant deux heures. Décanter la solution et laver la larve de poisson zèbre en utilisant 100 millimolaires de Tris HCL avec un pH de 7,5 ou 10 millimolaires de chlorure de magnésium. Pour la décoloration, décantez la solution et incuber la larve pendant cinq minutes dans une série de solutions comme décrit dans le manuscrit.
Après l’incubation finale, décanter la solution et enlever le pigment par blanchiment avec une solution composée de 3% de peroxyde d’hydrogène et de 0,5% d’hydroxyde de potassium. Observer une fois toutes les 10 minutes jusqu’à ce que le pigment soit complètement enlevé. Rincez la larve de poisson zèbre plusieurs fois avec 25% de glycérine, 0,1% d’hydroxyde de potassium pendant 10 minutes chacune jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles.
Colorer dans la larve en trempant dans un millilitre de 0,01% Alizarin. Décanter la solution et ajouter un millilitre de glycérine à 50% ou d’hydroxyde de potassium à 0,1% pour effacer le bruit de fond. Conservez le poisson dans de la glycérine fraîche à 50 % ou de l’hydroxyde de potassium à 0,1 % pour une observation ultérieure.
Transférez une larve à la fois sur la lame de verre en gardant la larve au milieu de la goutte liquide. Observez la larve au microscope stéréoscopique. Allumez l’appareil photo.
Ouvrez le logiciel et conservez les paramètres par défaut. Cliquez sur AE et choisissez un temps d’exposition approprié pour obtenir la meilleure image. Capturez toutes les images sous les mêmes paramètres.
Enregistrez les images au format point tiff pour une analyse ultérieure. Double-cliquez sur l’icône imageJ. Pour analyser les images enregistrées, cliquez sur fichier, puis ouvrez, puis cliquez sur image, puis tapez et sélectionnez huit bits.
Cliquez sur modifier et inversez. Cliquez sur analyser, puis calibrez. Sélectionnez OD non calibré dans l’interface contextuelle.
Vérifiez l’étalonnage global en bas à gauche de l’interface inférieure, puis cliquez sur OK. Cliquez sur analyser, définir l’échelle, puis supprimer l’échelle. Cochez la case globale ci-dessous, puis cliquez sur OK.
Cliquez sur analyser, puis définissez les mesures. Sélectionnez la zone d’élément dans l’interface contextuelle. Vérifiez la limite au seuil ci-dessous pour mesurer uniquement la plage sélectionnée, puis cliquez sur OK.
Cliquez sur l’image, ajustez, puis sur le seuil et faites glisser le curseur au milieu de l’interface contextuelle. Pour sélectionner le seuil approprié afin que toutes les cibles à tester dans une image soient sélectionnées. Et cliquez sur définir.
Cliquez sur analyser, puis mesurer, enregistrer les dates. La coloration rouge d’alizarine est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements dans la minéralisation osseuse chez les larves de poisson zèbre. Neuf jours après la fécondation, de nombreux os du squelette de la tête tels que parasphénoïdes, operculaires, cératobranchiaux et notochordes sont minéralisés et donc colorés en rouge.
En revanche, les structures non osseuses comme les otolithes apparaissent brun noir. L’analyse numérique effectuée pour quantifier la zone colorée totale a montré une diminution significative de la zone colorée pour les groupes de traitement à l’acétate de plomb de 10 et 20 milligrammes par litre. Les changements dans la minéralisation osseuse ont montré une dépendance à la dose.
Pour un meilleur effet de coloration et d’observation, il est important d’enlever le pigment d’origine des larves de poisson zèbre et d’enlever les bulles après le blanchiment.
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Aperçu
Cette étude utilise la coloration à l'alizarine rouge pour démontrer que l'exposition à l'acétate de plomb entraîne des modifications de la masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. La méthode peut être adaptée pour étudier la perte osseuse provoquée par divers toxiques dangereux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Toxicologie
- Biologie du développement
Contexte
- La coloration au rouge d'alizarine est une technique utilisée pour visualiser les structures squelettiques.
- Le poisson zèbre est un organisme modèle pour l'étude du développement osseux et de la toxicité.
- L'acétate de plomb est connu pour ses effets toxiques sur les systèmes biologiques.
- L'ostéoporose est caractérisée par une diminution de la masse osseuse, ce qui peut être modélisé chez le poisson zèbre.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'impact de l'acétate de plomb sur la masse osseuse chez les larves de zebrafish.
- Mettre en place une méthode permettant de détecter la toxicité osseuse induite par des produits chimiques.
- Faciliter la comparaison des modifications squelettiques entre différents spécimens.
Méthodes utilisées
- Coloration par le rouge d'alizarine de tissus de poisson zèbre fixés.
- Fixation de larves de poisson zèbre dans du paraformaldéhyde et du PBS.
- Lavage des larves avec du Tris HCl ou du chlorure de magnésium.
- Procédures de décoloration décrites dans le manuscrit.
Résultats principaux
- L'exposition à l'acétate de plomb a entraîné des changements observables de la masse osseuse.
- La méthode de coloration a fourni un enregistrement permanent des modifications squelettiques.
- Les résultats soutiennent l'utilisation du poisson zèbre comme modèle pour l'étude de l'ostéoporose.
- La méthodologie permet l'investigation d'autres toxiques dangereux.
Conclusions
- La coloration à l'alizarine rouge est efficace pour évaluer la toxicité osseuse chez le poisson zèbre.
- L'étude souligne le potentiel du poisson zèbre en recherche toxicologique.
- Des recherches supplémentaires pourraient approfondir les effets de divers toxiques sur la santé osseuse.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet la détection précoce d'une perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre, contribuant ainsi à l'analyse mécanistique des risques en toxicologie et à la validation des cibles pour les voies liées à la santé squelettique. En quantifiant les modifications des tissus minéralisés par coloration au rouge d'alizarine, elle fournit un résultat reproductible et dépendant de la dose pour évaluer les effets des composés sur la minéralisation osseuse. Cette approche renforce la fiabilité prédictive lors de l'optimisation des candidats médicaments et du criblage préclinique de sécurité pour les composés actifs sur l'os.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques liées à la minéralisation osseuse et à l'intégrité du squelette.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la détection biologique des risques en fournissant un enregistrement permanent et quantifiable des modifications squelettiques chez les spécimens.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en identifiant précocement, lors de la phase de découverte, les composés présentant des effets dose-dépendants sur la masse osseuse.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives de la surface colorée basées sur un seuil, permettant une comparaison objective entre les groupes expérimentaux.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles de préparation des échantillons et d’imagerie afin d’assurer la reproductibilité et la possibilité de passage à l’échelle dans des formats multi-puits.
- Prêt à l’essai : Génère des sorties numériques compatibles avec l’analyse par ImageJ, permettant le criblage à haut contenu des phénotypes de toxicité osseuse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Modélise les réponses squelettiques pertinentes pour l'humain face aux toxiques, soutenant l'alignement translationnel de biomarqueurs pour la perte osseuse.
- Valeur opérationnelle : Relie les phases de découverte et préclinique en fournissant un test conservé, basé sur un vertébré, de minéralisation osseuse.
- Atténuation des risques : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en détectant les signaux de perte osseuse avant les études chez les mammifères.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précliniques, en passant par l'évaluation préclinique de la sécurité, en particulier pour les composés présentant des effets potentiels hors cible sur les systèmes squelettiques.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les effets chimiques sur le développement osseux et les voies de minéralisation dans un modèle de vertébré.
- Écrantage : Permet la standardisation des tests et des lectures quantitatives pour détecter les variations dépendantes de la dose dans la surface colorée.
- Analytique : Fournit des mesures d'aire calibrées et basées sur des seuils, permettant des comparaisons statistiques de la minéralisation osseuse entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant les réponses squelettiques conservées aux toxiques chez les larves de zebrafish.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'écrantage de diverses bibliothèques chimiques afin d'évaluer les risques de toxicité osseuse.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies liées à l'os.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'extensibilité grâce à des étapes standardisées de fixation, de coloration et de quantification numérique.
- Valeur stratégique : Permet de mieux orienter les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant précocement des signaux quantitatifs de risque de perte osseuse.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque en identifiant les risques de toxicité squelettique avant tout investissement important.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des zebrafish, l'histologie et l'imagerie fluorescente ou colorimétrique.
- Dépend de la microscopie stéréo et de logiciels d'analyse d'images (par exemple, ImageJ) pour une quantification standardisée.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de coloration et des réglages de seuil afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension à d'autres systèmes modèles ou classes chimiques autres que l'acétate de plomb.
- Limité par la nécessité d'étapes de retrait des pigments et de clarification du fond pour garantir une détection précise du signal.
