Name: Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Apprenez à isoler des cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris avec une méthode fiable utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps. Cette technique préserve le rendement et la pureté pour diverses applications en biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par NIH T32GM008440 (JH / EW) et NIH R01AI058106 (JH). Nous reconnaissons le noyau de cytométrie en flux du Parnassus de l’UCSF (RRID:SCR_018206) soutenu en partie par la subvention NIH P30 DK063720 et par la subvention d’instrumentation NIH S10 1S10OD021822-01.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à San Francisco. Des bébés souris néonatales mâles C57BL/6 (âgés de 5 à 7 jours) ont été utilisés pour l’étude. L’ensemble du protocole prend de 7 à 10 jours (Figure 1).
1. Préparation du milieu cellulaire endothélial
<ol><li>Préparer le milieu basal : milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 4 500 mg/L de glucose et 4 mM de L-glutamine (DMEM) complétés par 20 % (v/v) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 100 U/100 μg/mL de pénicilline/streptomycine et 25 mM de HEPES (voir le tableau des matières). Filtre stérile avec filtre 22 μM. Conserver le milieu basal à 4 °C et l’utiliser dans le mois suivant sa préparation.</li>
	<li>Préparer le milieu complet : milieu basal supplémenté avec 100 μg/mL d’héparine, 100 μg/mL de supplément de croissance des cellules endothéliales, 1x acides aminés non essentiels et 1 mM de pyruvate de sodium (voir le tableau des matières). Filtre stérile avec filtre 22 μM. Conserver à 4 °C et utiliser dans le mois suivant la préparation.</li>
</ol>2. Prérevêtement de billes magnétiques anti-rats13
<ol><li>Préparer 50 mL de tampon de lavage des billes : Solution tamponnée au phosphate (PBS) additionnée d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % (p/v). Filtre stérile avec filtre 22 μM et conserver à 4 °C et utiliser dans le mois suivant la préparation.</li>
	<li>Tourbillonner les billes magnétiques pendant quelques secondes pour remettre en suspension les billes et pipeter 50 μL des billes (2 x 107 billes) dans deux tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL, un pour CD-31 et un pour CD-102 (voir le tableau des matériaux). Ajouter 1 ml de tampon de lavage des billes et bien mélanger. REMARQUE: Tous les volumes mentionnés ont été utilisés pour isoler les cellules endothéliales de 3-4 bébés souris néonatals (5-7 jours). CD-31 et CD-102 sont les marqueurs de surface des cellules endothéliales utilisés pour la sélection des immunobilles magnétiques.</li>
	<li>Placez les tubes sur un séparateur magnétique et retirez le surnageant avec une pipette Pasteur en verre. Répéter le lavage 3 fois avec 1 mL de tampon de lavage de billes à chaque fois.</li>
	<li>Resuspendre les billes dans le volume de perles d’origine, 50 μL, avec tampon de lavage des perles. Ajoutez ensuite 5 μL (2,5 μg) d’anticorps (CD-31/CD-102) à chaque 50 μL de billes.</li>
	<li>Incuber la suspension de billes en rotation douce sur un rotateur bout à bout pendant une nuit à 4 °C ou pendant 3 h à température ambiante. Répétez le lavage 4 fois.</li>
	<li>Remettez les immunobilles en suspension dans le volume d’origine, 50 μL, avec un tampon de lavage de billes et conservez-les à 4 °C et utilisez-les dans les 1-2 semaines.</li>
</ol>3. Isolement et placage des cellules pulmonaires
<ol><li>Préparer la solution de collagénase de type 1 le jour de l’isolement : Ajouter 25 mg de collagénase de type 1 à 25 mL d’HBSS (voir le tableau des matières). Incuber à 37 °C pendant 1 h avec une rotation douce et un filtre stérile à l’aide d’un filtre de 22 μM. Conserver la solution au chaud à 37 °C.</li>
	<li>Injecter de l’héparine (25 μL/souris, 1 000 U/mL) 10 min avant l’euthanasie à des bébés de 5 à 7 jours (25 μL/souris, 1 000 U/mL) 10 min avant l’euthanasie pour minimiser l’activation des cellules endothéliales et la formation de caillots14,15.</li>
	<li>Euthanasier le chiot souris avec décapitation à l’aide de ciseaux tranchants conformément aux directives 2020 de l’AVMA pour l’euthanasie. Ensuite, épinglez la souris à une planche de dissection avec le côté ventral vers le haut.</li>
	<li>Pulvériser la carcasse avec de l’éthanol à 70%, puis exposer la cavité thoracique en coupant d’abord le diaphragme, puis en coupant de manière supérieure vers le haut le long de toutes les parois latérales de la poitrine. Réfléchir la cage thoracique à l’époque expose le cœur et les poumons. REMARQUE: Utilisez des pinces et des ciseaux plus petits pour cette étape étant donné la petite taille des souris néonatales, et assurez-vous de ne pas percer le cœur ou les poumons car cela entraînerait une élimination inadéquate du sang des poumons.</li>
	<li>Fixez une aiguille de 25 G à une seringue de 10 ml et injectez 5 mL de DMEM froid dans le ventricule droit du cœur pour prélever le sang des poumons. Les poumons deviendront blancs.</li>
	<li>Retirez les poumons de la cavité thoracique, un lobe à la fois, en coupant les lobes distaux aux bronches correspondantes.</li>
	<li>Regrouper tous les lobes pulmonaires dans un tube conique de 50 mL prérempli de 20 mL de milieu basal glacé (à partir de l’étape 1.1).</li>
	<li>Répétez les étapes 3.2 à 3.7 avec les autres bébés souris, en regroupant tous les lobes pulmonaires dans le même tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Agitez doucement le tube à la main pendant 10-15 s pour laver tout excès de globules rouges visuellement apprécié à la surface des poumons. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le sang de l’intérieur ou autour des poumons; Cependant, cela améliore la pureté. Toute autre manipulation de tissu doit être effectuée dans une cagoule stérile.</li>
	<li>Utilisez une passoire cellulaire pour retirer les poumons du milieu et transférez le tissu dans une boîte de culture tissulaire stérile jetable de 100 mm de diamètre et hachez-le avec des ciseaux stérilisés.</li>
	<li>Transférer le tissu haché dans le tube conique de 50 ml avec 25 mL de solution de collagénase préchauffée (étape 3.1). Agiter doucement sur un batteur rotatif pendant 45 min à 37 °C. REMARQUE: Une surdigestion même pendant 60 minutes peut entraîner une baisse des rendements.</li>
	<li>Fixer une seringue de 20 mL à une canule émoussée de 15 G (voir le tableau des matières) et triturer la suspension 10 à 15 fois pour briser le tissu en une suspension cellulaire. Soyez vigoureux, mais évitez de trop mousser. REMARQUE: Il n’y aura plus de morceaux visibles du poumon, et à la place, la suspension sera trouble à la fin de cette étape.</li>
	<li>Filtrer la suspension à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL. De plus, rincer le tube conique utilisé pour la digestion et la passoire cellulaire avec 15 mL supplémentaires de milieu basal.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 8 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur en verre et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu complet. Transvaser dans une fiole T-75 et ajouter 8 mL de culture moyenne complète à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Le lendemain, laver les flacons deux fois avec 10 ml de solution saline équilibrée de Hank’s sans calcium ni magnésium (HBSS/CMF) (voir le tableau des matières) et ajouter 10 ml de milieu complet. REMARQUE : Après 2-3 jours, la culture sera confluente à 90-95% et prête pour l’isolement primaire des immunobilles.</li>
</ol>4. Isolement primaire des immunobilles et culture de cellules endothéliales
<ol><li>Laver deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 ml de hbss/cmf. Ajouter 2 mL de solution de détachement cellulaire sans trypsine (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Assurez-vous que toutes les cellules ont été retirées de la fiole. REMARQUE: Une solution de décollement sans trypsine doit être utilisée à la place de la trypsine car la trypsine peut perturber le marqueur d’adhésion de surface cellulaire CD-31.</li>
	<li>Ajouter 8 mL de milieu basal pour neutraliser la solution de décollement cellulaire et transférer le contenu dans un tube conique de 15 mL. Faire tourner à 400 x g pendant 4 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu basal. Transférer la suspension cellulaire de 2 mL dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Perles enduites anti-CD-31 de vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension et ajouter 30 μL de billes pour chaque 2 mL de suspension cellulaire. Fixez le couvercle.</li>
	<li>Incuber le tube pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur bout à bout. Placez ensuite les tubes sur un séparateur magnétique et laissez reposer 2 min.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, aspirer le surnageant. Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant 3 ml de milieu basal au tube et pipette de haut en bas plusieurs fois.</li>
	<li>Replacez le tube du séparateur magnétique pendant 2 min, puis aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Répéter les lavages (étapes 4.6-4.7) au moins 4 fois jusqu’à ce que le surnageant apparaisse clair.</li>
	<li>Après le lavage final, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans un milieu de croissance complet de 3 mL et la transférer dans une fiole T-75. Ajouter 7 mL du milieu de croissance complet et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .</li>
	<li>Le lendemain, lavez les cellules avec HBSS/CMF, puis ajoutez 10 ml de milieu frais complet. Remplacer le média par 10 ml de milieu complet frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce qu’il conflue à 90-95%. REMARQUE: Une fois que les cellules sont ~90-95% confluentes, ce qui prend ~3-4 jours, la culture est prête pour l’isolement secondaire de l’immunobille.</li>
</ol>5. Isolement et culture de cellules endothéliales d’immunobilles secondaires
<ol><li>Lavez deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 ml de HBSS/CMF. Ajouter 2 mL de solution de détachement cellulaire sans trypsine et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Assurez-vous que toutes les cellules ont été retirées de la fiole.</li>
	<li>Ajouter 8 mL de milieu basal pour neutraliser la solution de détachement cellulaire et transférer dans un tube conique de 15 mL. Faire tourner à 400 x g pendant 4 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu basal. Transférer la suspension cellulaire de 2 mL dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL.</li>
	<li>Perles enduites anti-CD-102 de vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension et ajouter 30 μL de billes pour chaque 2 mL de suspension cellulaire. Fixez le couvercle.</li>
	<li>Incuber le tube pendant 10 min à température ambiante sur un rotateur bout à bout. Placez les tubes sur un séparateur magnétique et laissez reposer 2 min. Puis aspirer doucement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant 3 ml de milieu basal au tube et pipette de haut en bas plusieurs fois.</li>
	<li>Replacez le tube du séparateur magnétique pendant 2 min avant d’aspirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Répétez les lavages (étapes 5.6-5.7) 4 fois ou plus jusqu’à ce que le surnageant apparaisse clair.</li>
	<li>Après le lavage final, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans un milieu de croissance complet de 3 mL et la transférer dans une fiole T-75. Ajouter 7 ml de milieu de croissance complet et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Le lendemain, lavez les cellules avec HBSS/CMF, puis ajoutez 10 ml de milieu frais complet. Remplacer le média par 10 ml de milieu complet frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce qu’il conflue à 90-95%. Une fois que les cellules endothéliales sont complètement confluentes, elles sont prêtes pour l’expérimentation. Les cellules ne doivent pas être utilisées au-delà du passage six car la sénescence peut se produire et d’autres types de cellules peuvent prendre le relais.</li>
</ol>6. Confirmation des marqueurs de surface des cellules endothéliales par cytométrie en flux
<ol><li>Après avoir utilisé une solution de détachement cellulaire sans trypsine pour détacher les cellules, remettre en suspension la pastille cellulaire à 1 x 10 5 cellules/mL et aliquoter 100 μL de la suspension cellulaire dans trois tubes microcentrifugés de1,5 mL, marqués 1, 2 et 3.</li>
	<li>Lavez les cellules avec 1 mL de 1x PBS. Centrifuger à 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez le tampon de lavage et répétez deux fois.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 100 μL de 1x PBS. Dans le tube 1, ajouter 1 μL d’anticorps conjugué anti-souris CD-31 (PECAM-1) (ex: anticorps anti-souris CD-31 phycoérythrine (PE)) et 1 μL d’anticorps CD-102 anti-souris conjugué (ICAM-2) (ex: anticorps anti-souris CD102 anti-souris isothiocyanate de fluorescéine (FITC)) (voir le tableau des matériaux). Au tube 2, ajoutez les contrôles d’isotype appropriés. Le tube n° 3 restera intact.</li>
	<li>Incuber les tubes sur la glace et dans l’obscurité pendant 30-45 min.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS dans chaque tube, vortex doucement et centrifuger à 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le lavage et répéter trois fois. Remettez en suspension la pastille finale dans 500 μL de PBS.</li>
	<li>Maintenir les tubes recouverts de papier d’aluminium à 4 °C jusqu’à l’analyse. L’analyse doit être terminée dans les 3-4 heures.</li>
	<li>Acquérir des données de flux à l’aide d’un cytomètre. Utilisez un échantillon non coloré comme contrôle négatif pour régler correctement la tension laser en fonction de l’autofluorescence de la cellule. Porte la population cellulaire totale avec un tracé de dispersion vers l’avant et un diagramme de dispersion latérale. REMARQUE : Après exclusion des doublets, les cellules CD31+ CD102+ double-positives sont définies comme des cellules endothéliales.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole simple se prête aux cellules endothéliales de haute pureté provenant de poumons murins. Bien que le temps total du début à la fin soit de 7 à 10 jours, le temps de pratique est d’environ 3 à 4 h. Par rapport aux autres méthodes13,14,15,16, le protocole actuel est rationalisé, en conservant les étapes essentielles sans compromettre le rendement et la pureté.
Il convient de noter certains aspects essentiels de ce protocole. Tout d’abord, il est important d’utiliser des chiots néonatals plutôt que des souris adultes. D’après notre expérience, les cellules endothéliales de souris adultes ne prolifèrent pas aussi facilement que les cellules de chiots néonatals, et elles sont facilement envahies par des cellules dont la morphologie fusiforme correspond à celle des fibroblastes ou des cellules souches mésenchymateuses15,16. Une explication possible de la différence est que le développement pulmonaire est au stade alvéolaire chez les souris néonatales, caractérisé par la prolifération plus rapide des cellules endothéliales20. Il peut également y avoir un certain degré de sénescence avec le vieillissement21. Le temps de digestion enzymatique doit également être précis, car la sous-digestion peut conduire à une suspension unicellulaire à faible rendement. En revanche, une surdigestion peut entraîner une quantité substantielle de mort cellulaire. Nous avons déterminé que le temps optimal pour la digestion de la collagénase est déterminé à 45 minutes. Ceci est ensuite suivi d’une dissociation mécanique avec une canule émoussée. L’instillation de collagénase intratrachéale au cours de la digestion enzymatique a également été rapportée14,15; Cependant, cela peut prendre beaucoup de temps et conduire à une digestion incomplète pendant les travaux en cours. Enfin, certains protocoles procèdent directement à l’isolement des immunobilles immédiatement après la digestion enzymatique13,16. Nous avons constaté que la culture des cellules du poumon dissocié dans le milieu pendant un jour ou deux avant de faire la sélection de l’immunobille augmente considérablement le rendement des cellules endothéliales viables et très pures. Cela peut être lié à la vitesse à laquelle les cellules isolées pénètrent dans le milieu de culture tissulaire, ce qui entraîne moins de mort cellulaire dans les premiers stades après le retrait des souris, une densité d’ensemencement initiale plus élevée et le temps nécessaire aux cellules endothéliales d’adhérer et de proliférer avant le premier isolement de billes d’immunobilles.
Les limites de la préparation et de l’analyse des cellules endothéliales de souris sont les suivantes. Chaque souris ne fournit qu’un nombre limité de cellules qui doivent être utilisées en quelques passages. Ce problème peut être surmonté en regroupant la digestion pulmonaire de plusieurs souris. Malheureusement, nous n’avons pas réussi dans nos efforts pour cryoconserver et décongeler les cellules pour une utilisation future. Malgré ces limitations, les cellules endothéliales de souris présentent certains avantages. Ils peuvent être utiles, en particulier dans les situations où les cellules endothéliales humaines ne peuvent pas être utilisées (p. ex., élimination génique), lorsque des études complémentaires sont nécessaires pour corroborer les résultats avec des cellules humaines ou lorsque l’hétérogénéité des réponses des cellules endothéliales de différents donneurs humains rend la reproductibilité entre les expériences problématique6. La population homogène de cellules endothéliales de souris génétiquement identiques permet la reproductibilité entre les expériences et l’étude de gènes et de voies spécifiques dans des conditions de fond stables.
Les cellules endothéliales de souris peuvent être utilisées pour de multiples applications afin de fournir des informations sur l’activation endothéliale et le dysfonctionnement dans différents processus pathologiques. Par exemple, les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la septicémie, contribuant à la fois aux réponses bénéfiques et pathologiques par leur rôle dans l’activation de l’inflammation localisée et systémique, la promotion du trafic et de l’activation des leucocytes dans les tissus, la régulation de la coagulation et la modulation de la perméabilité endothéliale 2,22,23 . Ce protocole simple fournit des cellules endothéliales viables et fonctionnelles qui peuvent être utilisées dans des tests pour chacun de ces processus endothéliaux.

L’intérêt pour l’étude de l’endothélium vasculaire a augmenté récemment, car le dysfonctionnement des cellules endothéliales microvasculaires se produit dans de multiples maladies humaines, telles que les accidents vasculaires cérébraux, les maladies cardiovasculaires, le diabète, les lésions pulmonaires aiguës, la septicémie et les blessures non infectieuses 1,2,3,4,5. Pour définir la pathogenèse de ces conditions et comprendre les rôles de gènes spécifiques dans les réponses protectrices et dérégulées des cellules endothéliales, il est nécessaire de disposer de méthodes fiables pour isoler et cultiver des cellules endothéliales microvasculaires de haute pureté à partir de souris. Alors que de nombreuses études utilisent des cellules endothéliales humaines telles que les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) ou les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HMVEC), il existe de multiples raisons d’utiliser des cellules endothéliales de souris pour étudier la fonction endothéliale et le dysfonctionnement. Premièrement, il existe une hétérogénéité considérable dans les réponses des cellules endothéliales de différents donneurs humains, ce qui entraîne une variabilité des résultats entre les expériences individuelles 6,7,8. Deuxièmement, le silençage des cibles géniques dans les lignées cellulaires humaines primaires peut également conduire à des niveaux d’expression protéique variables 9,10. En revanche, il y a une hétérogénéité minimale dans les réponses des cellules endothéliales de souris11, en supposant que le fond génétique est le même entre les groupes d’étude. En outre, un grand nombre de cellules endothéliales de souris peuvent être préparées en regroupant les poumons de plusieurs souris néonatales. Ces facteurs permettent d’obtenir des résultats plus cohérents et reproductibles entre les expériences. Enfin, la disponibilité de souris knockout ou transgéniques permet également d’isoler des types cellulaires dépourvus de protéines d’intérêt.
Les défis considérables liés à l’isolement de populations saines et pures de cellules endothéliales pulmonaires de souris à l’aide des méthodes publiées 12,13,14,15,16 ont conduit au développement d’une méthode plus fiable et plus simple pour isoler des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires de souris de haute qualité. Les avantages du protocole actuel comprennent l’utilisation de souris néonatales, qui sont facilement disponibles, limitant les coûts d’élevage et de logement. De plus, selon notre expérience, la viabilité des cellules endothéliales de souris néonatales est considérablement plus élevée que celle des cellules endothéliales préparées à partir de souris adultes. Parce que les souris néonatales ont un petit tissu pulmonaire, les cellules endothéliales peuvent être récoltées en digérant les poumons excisés en collagénase plutôt que d’utiliser l’instillation trachéale de collagénase, qui est recommandée pour la collecte sur des souris adultes16. Cela réduit également le temps entre l’euthanasie des souris et l’introduction de leurs cellules endothéliales dans les milieux de culture cellulaire et l’incubateur sans affecter la pureté, le rendement ou la reproductibilité des réponses endothéliales. Enfin, les populations de cellules pures ont été isolées sans cytométrie en flux, ce qui peut endommager ou entraîner une baisse des rendements des cellules endothéliales14,15,17.
Le protocole modifié actuel conduit systématiquement à des cellules endothéliales de haute pureté et viables en 7 à 10 jours qui peuvent être utilisées immédiatement pour des expériences in vitro . L’isolement des cellules directement des animaux knock-out minimise également la manipulation des cellules avant l’expérimentation. Ces méthodes pourraient être utilisées pour étudier le rôle de diverses protéines dans la fonction endothéliale afin de découvrir des cibles thérapeutiques endothéliales pour de multiples maladies.

<table><tbody><tr><td>50 mL coniques</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Solution de détachement de cellules</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Aiguille 25 g x 5/8 po</td> <td>Becton Disckinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td> Canule <td>émoussée BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g x 1-1/2 po</td> <td>8881202314</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-102 Anti-souris pour rats (3C4 (MIC2/4))</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 Anti-souris pour rats (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase, Type 1</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouton Anti-Rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de croissance cellulaire endothéliale</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à cellules Falcon (70 &micro ; m)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, inactivé par la chaleur</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils pour les sciences</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipettes jetables en verre borosilicaté</td><td>Pasteur Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-souris CD102 (3C4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a,&nbsp ; &kappa ; Contrôle des isotypes (R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique injectables (1 000 unités/mL)</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat Anti-souris CD31 (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a,&nbsp ; &kappa ; &nbsp ; Contrôle des isotypes R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL, 10 000 & micro ; g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murin IFN-&gamma ;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Murin recombinant IL-1&beta ;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murin TNF-& alpha ;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à essai en polystyrène à fond rond</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP Système de filtration stérile sous vide, 250 mL</td><td>Millipore</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unité de filtration supérieure à tube de centrifugeuse stérile</td><td>Milipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile (10 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile (20 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T-75 avec bouchon d’aération, traitée CellBIND</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation du tonus vasculaire, de l’immunité, de la coagulation et de la perméabilité. Le dysfonctionnement endothélial se produit dans des conditions médicales, y compris le diabète, l’athérosclérose, la septicémie et les lésions pulmonaires aiguës. Une méthode fiable et reproductible pour isoler les cellules endothéliales pures de souris est nécessaire pour étudier le rôle des cellules endothéliales dans la pathogenèse de ces conditions et d’autres. Dans ce protocole, des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires ont été préparées à partir de bébés souris néonatals âgés de 5 à 7 jours. Les poumons sont récoltés, hachés et digérés enzymatiquement avec de la collagénase I, et les cellules libérées sont cultivées pendant la nuit. Les cellules endothéliales sont ensuite sélectionnées à l’aide d’IgG anti-PECAM1 (CD-31) conjuguées à des billes magnétiques, et les cellules sont à nouveau cultivées pour confluence. Une sélection cellulaire secondaire se produit ensuite avec des IgG anti-ICAM2 (CD-102) conjuguées à des billes magnétiques pour augmenter la pureté des cellules endothéliales, et les cellules sont à nouveau cultivées à confluence. L’ensemble du processus prend environ 7 à 10 jours avant que les cellules puissent être utilisées pour l’expérimentation. Ce protocole simple produit des cellules endothéliales très pures (pureté >92%) qui peuvent être immédiatement utilisées pour des études in vitro , y compris les études axées sur la production de cytokines endothéliales et de chimiokines, les interactions leucocytaire-endothéliale, les voies de coagulation endothéliale et la perméabilité endothéliale. Avec de nombreuses lignées de souris transgéniques disponibles, cette procédure se prête également à la compréhension de la fonction de gènes spécifiques exprimés par les cellules endothéliales dans les réponses saines et pathologiques aux blessures, aux infections et à l’inflammation.

Ce protocole simple permet d’isoler, de cultiver et de caractériser des cellules endothéliales microvasculaires de souris pendant 7 à 10 jours (Figure 1). Brièvement, les poumons sont excisés et digérés enzymatiquement avant le placage. Immédiatement après le placage, les cellules endothéliales et d’autres cellules flotteront dans les milieux de culture cellulaire. Le lendemain, les cellules endothéliales et les cellules contaminantes seront collées à la plaque, et une technique de lavage vigoureuse est nécessaire pour éliminer les débris et les cellules flottantes. Une fois que les cellules atteignent la confluence, la première sélection d’immunobilles est effectuée. Les cellules CD-31-positives commencent alors à se développer dans une formation pavée (Figure 2). Les cellules qui n’ont pas de morphologie pavée ou qui ne prolifèrent pas sont des contaminants et non des cellules endothéliales13,14,15,16.
Une deuxième sélection d’immunobilles est ensuite effectuée à l’aide de billes enrobées d’anti-CD-102 pour augmenter la pureté des cellules endothéliales, similaire aux autres protocoles13,16. Les cellules qui ont grandi jusqu’à confluer après la deuxième sélection immunobille peuvent ensuite être utilisées pour l’expérimentation. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est utilisé pour confirmer que la population cellulaire est CD-31 et CD-102-positive (Figure 3).
Ces cellules endothéliales peuvent ensuite être utilisées pour de nombreuses applications, telles que l’étude des voies inflammatoires endothéliales et de la fonction de barrière endothéliale. Par exemple, il a été observé que le traitement avec un cytomix murin (IFNg, TNFa et IL1b, chacun à 10 ng / mL) induisait la production d’IL-6 par les cellules endothéliales (Figure 4A). Ensuite, ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing)18 a été utilisé pour mesurer la résistance transendothéliale (TER) au flux de courant électrique à travers les monocouches de cellules endothéliales pulmonaires murines. Il a été observé que les cellules traitées avec cytomix entraînaient une diminution du TER (Figure 4B), ce qui est compatible avec une augmentation de la perméabilité endothéliale. Ces exemples illustrent comment les cellules endothéliales préparées à l’aide de ce protocole peuvent étudier divers processus endothéliaux. Cela permet aux chercheurs d’étudier plus facilement les gènes d’intérêt dans les cellules endothéliales, compte tenu du nombre toujours croissant de souris knockout et transgéniques disponibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma d’isolement des cellules endothéliales pulmonaires murines. Les poumons des chiots néonatals âgés de 5 à 7 jours sont récoltés et hachés. Le tissu haché a été digéré enzymatiquement avec de la collagénase I. La suspension cellulaire est plaquée et cultivée pendant 2-3 jours. Les cellules subissent ensuite un isolement primaire de l’immunobille avec des billes enrobées de CD-31 et sont cultivées pendant 3-4 jours supplémentaires. Deuxième isolement de billes immunologiques avec des billes enduites de CD-102 avant la culture de 2-3 jours supplémentaires. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’expérimentation fonctionnelle. L’image a été créée par un outil d’illustration basé sur le Web, Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg"> Figure 2 : Morphologie des cellules endothéliales pulmonaires murines. Les cellules endothéliales pulmonaires murines en culture présentent une morphologie pavée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg"> Figure 3 : Analyse des cellules endothéliales par cytométrie en flux. (A) Tous les événements sont visualisés sur un graphique à points de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC). (B) Confirmation par nuage de points que les cellules endothéliales pulmonaires murines sont positives pour les antigènes de surface cellulaire spécifiques de l’endothélium CD-31 et CD-102. (C) Histogramme de l’échantillon d’isotype et de l’échantillon coloré avec des anticorps spécifiques CD-31/CD-102. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg"> Figure 4 : Le cytomix induit la production d’IL-6 dans les cellules endothéliales pulmonaires murines et la perméabilité des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires murines de souris C57BL / 6 ont été traitées avec cytomix (IFNg, TNFa et IL1b, chacune à 10 ng / mL). (A) Les concentrations d’IL-6 ont ensuite été quantifiées dans les surnageants de culture à 15 h (**p&lt;0,01, n = 4 puits/état). (B) La détection d’impédance cellule-substrat électrique a été utilisée pour mesurer la résistance transendothéliale (TER) à plusieurs reprises sur 15 heures. Les données ont été normalisées à la résistance immédiatement avant l’ajout du cytomix tel que désigné et ont été analysées par analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du post-test de Tukey19 (**p&lt;0,01, n = 4 puits/condition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Dans cet article, des cellules endothéliales pulmonaires primaires ont été isolées et cultivées à partir de souris néonatales.

Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Le protocole démontre une méthode fiable et reproductible pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de haute pureté à partir de souris qui pourraient avoir de multiples applications. Cette technique est une méthode plus simple qui préserve le rendement et la pureté des cellules endothéliales. La démonstration de la procédure sera assurée par Nina Nguyen, une associée de recherche de mon laboratoire.Pour commencer, faites tourbillonner les billes magnétiques pendant quelques secondes. Pipeter 50 microlitres des billes dans deux tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre pour CD31 et CD102. Ajouter un millilitre de tampon de lavage de perles et bien mélanger.Placez les tubes sur un séparateur magnétique et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Remettez les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage des perles. Ajoutez ensuite cinq microlitres ou 2,5 microgrammes d’anticorps CD31 ou CD102 à tous les 50 microlitres de billes.Incuber la suspension de billes avec rotation douce sur un rotateur d’extrémité sur extrémité pendant une nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois heures à température ambiante. Lavez les immunobilles quatre fois, puis remettez les immunobilles en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage des perles. Le jour de l’isolement, ajoutez 25 millilitres de HBSS à 25 milligrammes de collagénase de type un et incuberez-le avec une rotation douce.Ensuite, filtrez à l’aide d’un filtre de 22 micromètres. Après avoir euthanasié un chiot souris âgé de cinq à sept jours, vaporisez la carcasse avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, coupez le diaphragme vers le haut le long de toute la paroi latérale de la poitrine pour exposer la cavité thoracique.Injectez cinq millilitres de DMEM froid dans le ventricule droit du cœur jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs. Ensuite, coupez les lobes distaux aux bronches correspondantes un par un pour enlever les poumons. Tirez les lobes pulmonaires dans un tube conique de 50 millilitres prérempli de 20 millilitres de milieu basal glacé.Agitez doucement le tube à la main pendant 10 à 15 secondes pour laver tout excès de globules rouges. Retirez les poumons du média avec une passoire cellulaire et hachez avec des ciseaux stérilisés. Transférer le tissu haché dans le tube conique de 50 millilitres avec 25 millilitres de solution de collagénase préchauffée.Agiter doucement sur un batteur rotatif. Fixez une seringue de 20 millilitres à une canule émoussée de calibre 15 et triturez vigoureusement la suspension sans mousser 10 à 15 fois dans une suspension cellulaire. Filtrer la suspension à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.Rincez ensuite le tube conique utilisé pour la digestion et la passoire cellulaire avec 15 millilitres de milieu basal. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu complet.Ajouter huit millilitres de milieu complet et incuber. Le lendemain, laver les flacons deux fois avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium et ajouter 10 millilitres de milieu complet. Une fois que les cellules sont confluentes à 90 à 95 %, elles sont prêtes pour l’isolement primaire des immunobilles.Lavez deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium. Ajouter deux millilitres de solution de détachement cellulaire sans trypsine et l’incuber pour assurer le soulèvement de toutes les cellules du flacon. Ajouter huit millilitres de milieu basal.Ensuite, faites tourner les cellules à 400 fois G pendant quatre minutes à température ambiante et remettez-les en suspension dans deux millilitres du milieu basal. Perles enduites anti-CD31 Vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension. Ajoutez 30 microlitres de billes pour chaque deux millilitres de suspension cellulaire et fixez le couvercle.Incuber le tube pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur d’extrémité au-dessus de l’extrémité. Placez ensuite les tubes sur un séparateur magnétique pendant deux minutes. Aspirez le surnageant et retirez le tube de l’aimant.Remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant trois millilitres de milieu basal au tube et en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Replacez le tube du séparateur magnétique pendant deux minutes. Aspirez ensuite soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.Après le lavage final, lorsque le surnageant devient clair, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans trois millilitres de milieu de croissance complet et la transférer dans une fiole T75. Ajouter sept millilitres du milieu de croissance complet et l’incuber. Le lendemain, relavez les cellules avec HBSS sans calcium ni magnésium.Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu complet. Une fois que les cellules sont confluentes à 90 à 95 %, elles sont prêtes pour l’isolement secondaire des immunobilles. La première sélection d’immunobilles identifie les cellules CD31 positives, qui se développent dans une formation pavée.Une deuxième sélection d’immunobilles avec des billes enrobées d’anti-CD102 augmente la pureté des cellules endothéliales et le tri cellulaire activé par fluorescence est utilisé pour confirmer que la population cellulaire est CD31 positive et CD102 positive. Pour étudier les voies inflammatoires endothéliales et la fonction de barrière endothéliale, un traitement par Cytomix murin a été utilisé pour induire une production significative d’IL-6 par les cellules endothéliales avec une valeur P inférieure à 0,01. De plus, la résistance transendothéliale a diminué, montrant une perméabilité endothéliale accrue.Les cellules endothéliales isolées peuvent être utilisées dans les stimulations des cellules endothéliales ou les tests de fonction barrière pour découvrir des cibles thérapeutiques endothéliales pour les troubles de dysfonctionnement endothélial.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) sont interconnectées par des protéines jonctionnelles spécifiques formant une barrière hautement régulée séparant le sang et le système nerveux central (SNC), ce que l’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires murines, comme nous l’avons vu dans ce protocole, permet des études in vitro détaillées de la BHE.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle important dans de nombreux troubles cardiovasculaires importants. Cet article décrit une méthode simple pour isoler et étendre les cellules endothéliales de l’aorte de souris sans utiliser d’équipement spécial. Notre protocole fournit un moyen efficace d’identifier les mécanismes de la physiopathologie des cellules endothéliales.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

Ce protocole est préparé pour partager notre méthode d’isolement des cellules endothéliales coronaires de souris à des fins d’imagerie ou pour mener des expériences de biologie moléculaire.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Bien que difficile, l’isolement des cellules endothéliales pulmonaires est essentiel pour les études sur l’inflammation pulmonaire. Le présent protocole décrit une procédure pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires.

Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons

Ce protocole décrit l’isolement de cellules endothéliales de souris à partir de pancréas entier.

Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

Ce protocole détaille l’isolement de populations immunes et non immunes vivantes du poumon de souris à l’état d’équilibre et après une infection grippale. Il fournit également des stratégies de contrôle pour identifier les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes.

Isolement de populations de cellules myéloïdes et épithéliales vivantes à partir du poumon de souris

Apprenez à isoler des cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris avec une méthode fiable utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps. Cette technique préserve le rendement et la pureté pour diverses applications en biologie cellulaire.

Isolement de cellules endothéliales pulmonaires primaires de souris

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