Name: Évaluation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez une méthode qRT-PCR pour quantifier l'expression des microARN dans le rein et le sérum de souris présentant une insuffisance rénale liée à l'âge. Cette technique offre précision et sensibilité pour l'étude des maladies rénales.

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Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Les niveaux d’expression des miARN cibles ont été déterminés avec succès par le protocole décrit ci-dessus en utilisant la qRT-PCR. L’évaluation des miARN extraits est une étape importante dans l’obtention de données qRT-PCR significatives. Pour confirmer la qualité adéquate des miARN avant d’effectuer la qRT-PCR, la spectrophotométrie doit être utilisée pour déterminer le rapport d’absorbance à 260 nm à celui à 280 nm. Une contamination de l’ADN peut se produire et/ou des dimères d’amorce dans chaque puits de la plaque de réaction peuvent être présents si la qRT-PCR ne fournit pas une seule amplification PCR de la longueur et de la température de fusion prévues, ou si elle fournit une courbe de fusion monomodale.
Les niveaux d’expression des miARN peuvent être évalués par plusieurs méthodes autres que la qRT-PCR, y compris le transfert de Northern, un microréseau et des tests de protection contre les ribonucléases. Cependant, la méthode qRT-PCR est une procédure sensible, précise, simple et reproductible qui nécessite un volume d’échantillon inférieur à ceux requis pour les tests de Northern blot et de protection contre la ribonucléase19. Étant donné que les puces à ADN peuvent mesurer l’expression de dizaines de milliers de miARN simultanément, elles peuvent être utilisées pour identifier les marqueurs de miARN candidats. Les données des puces à ADN montrent également une forte corrélation globale avec les données obtenues par qRT-PCR20. Cependant, aucun consensus n’a été atteint quant à la méthodologie optimale pour comparer les données de microréseaux obtenues dans différentes études21.
L’évaluation des miARN sériques présente les caractéristiques suivantes. Tout d’abord, il est facile de recueillir du sérum, et comme les miARN sériques sont stables contre le gel et la décongélation, la température et l’acide, les miARN peuvent être de bons biomarqueurs. Deuxièmement, il existe une forte homologie des miARN entre les espèces, et les résultats des expériences sur les animaux sont facilement extrapolés aux humains. Troisièmement, les miARN sériques ont montré un potentiel d’utilisation en tant que médicaments thérapeutiques3. Plusieurs études ont également démontré que le niveau d’expression des miARN dans les organes est corrélé avec le miARN dans le sérum22,23,24. Dans la présente étude, miRNA-223-3p, dont les taux rénaux n’ont pas montré de différence significative entre les souris SAMR1 et SAMP1, n’a pas non plus montré de différence significative entre les souches dans le sérum. En revanche, miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p, dont les niveaux rénaux ont montré une différence significative entre les souris SAMR1 et SAMP1, ont montré des différences considérables entre les souches dans le sérum.
Ce protocole présente les limitations suivantes. Premièrement, son utilité n’a pas été vérifiée dans d’autres organes tels que le foie et les poumons, et deuxièmement, il n’a pas été testé sur d’autres animaux de laboratoire tels que les rats, les chiens et les porcs. Plusieurs groupes de recherche ont utilisé ce protocole pour la purification et la détection des miARN par qRT-PCR et ont rapporté que ce protocole permettait la purification d’ARN de haute qualité à partir de tissus et de sérum 13,14,22,23,24. Il a été démontré que cette méthode a une précision et une sensibilité élevées pour détecter l’expression des miARN 13,14,22,23,24. Les résultats de la présente étude démontrent que ce protocole peut détecter avec succès l’expression de miARN dans le sérum et les reins de souris. Par conséquent, le protocole peut être utilisé pour déterminer les profils d’expression des miARN sériques et rénaux chez les souris présentant diverses pathologies. En raison de la simplicité du protocole, un grand nombre d’échantillons peuvent être traités simultanément. Les analyses de l’expression de nombreux miARN dans diverses conditions pathologiques du rein peuvent donc utiliser le protocole décrit ici.
Il y a certains aspects du protocole à garder à l’esprit. Pour éviter la dégradation des miARN purifiés qui se produirait à température ambiante, les miARN doivent être conservés sur de la glace. Les échantillons de rein doivent être homogénéisés jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous dans le réactif de lyse. Le rein de souris contient une quantité substantielle de tissu conjonctif qui est insoluble dans le réactif de lyse, et donc un broyeur de colonne est nécessaire pour une homogénéisation plus poussée. De plus, le miARN témoin endogène approprié (avec une expression stable parmi les échantillons) doit être validé tout au long de la mise en place d’une expérience qRT-PCR. En effet, l’interférence de diverses substances pendant l’exécution de ce protocole peut modifier les niveaux d’expression des miARN de contrôle endogènes, ce qui peut compromettre les résultats. En conclusion, cet article décrit un protocole qRT-PCR pour la détection, la purification et l’évaluation de l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge.

L’expression de divers ARNm qui jouent un rôle important à la fois dans la physiologie et la maladie (par exemple, l’inflammation, la fibrose, les troubles métaboliques et le cancer) est connue pour être régulée par les miARN, qui sont de courts ARN non codants qui causent la dégradation et inhibent la transcription de l’ARNm1. Il est donc possible que certains miARN puissent servir de nouveaux biomarqueurs et/ou cibles thérapeutiques candidats pour diverses maladies 2,3,4,5. Des recherches ont été menées sur les profils d’expression des miARN dans une variété d’organes et de tissus de souris (y compris le cerveau6, le cœur7, le poumon8, le foie9 et le rein10). Cependant, il n’existe pas de méthodes standard ou établies pour extraire et évaluer les miARN dans les reins ou le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge.
Par conséquent, nous avons établi un protocole qui peut être utilisé pour purifier et détecter de manière fiable l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale liée à l’âge. Le protocole comporte six étapes principales : (1) préparation des souris mâles SAMR1 âgées de 50 semaines et des souris mâles SAMP1 ; 2) l’extraction d’échantillons de sang de la veine cave inférieure des deux souches de souris, suivie de l’utilisation d’un tube à bec contenant de l’héparine, suivie d’une centrifugation, pour obtenir un échantillon de sérum; (3) l’extraction de l’échantillon de rein de l’homogénéisateur de silicium de souris-A est utilisée pour homogénéiser l’échantillon de rein séparément, et l’échantillon est ensuite transféré dans un système de déchiquetage de biopolymères sur une colonne de spin de microcentrifugeuse11; (4) extraction d’ARN total (contenant des miARN) à partir des échantillons de sérum à l’aide d’une colonnede spin 12 à base de membrane de silice et d’ARN total contenant de l’ARN miARN à partir des échantillons de rein à l’aide d’une colonne de spin11 à base de membrane de silice; (5) synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN total à l’aide de la transcriptase inverse, de la poly(A) polymérase et de l’amorce oligo-dT13,14; et (6) enfin, la détermination de l’expression des miARN à l’aide de qRT-PCR et d’un colorant intercalant13,14.
Ce nouveau protocole était basé sur des études qui ont réussi à extraire et à évaluer des miARN dans divers types de tissus11,12,13. Il a été démontré que le système de déchiquetage des biopolymères du protocole était capable de purifier l’ARN total de haute qualité des tissus11. La précision et la sensibilité des aspects de ce protocole utilisés pour l’évaluation de l’expression des miARN par qRT-PCR avec un colorant intercalant ont été établies13,14, par exemple, la synthèse de l’ADNc avec transcriptase inverse, poly(A) polymérase, et oligo-dT amorces à partir de l’ARN total extrait. Le nouveau protocole présente plusieurs avantages : simplicité, gain de temps et réduction des erreurs techniques. Il peut donc être utilisé pour des investigations qui nécessitent une identification précise et sensible des profils de miARN rénaux et sériques. Les études de nombreuses conditions pathologiques peuvent également utiliser le nouveau protocole.
Les profils d’expression des miARN chez les souris SAMP1, qui sont un modèle d’insuffisance rénale dépendante de l’âge, peuvent être déterminés comme indiqué ci-dessous. Chez l’homme, l’insuffisance rénale dépendante de l’âge est associée à la progression de l’insuffisance rénale et se caractérise à la fois par une augmentation de la zone de fibrose interstitielle rénale et par la progression de la glomérulosclérose15,16. L’insuffisance rénale liée à l’âge est également une caractéristique importante et fréquente de l’insuffisance rénale chronique et de l’insuffisance rénale terminale15,16.

<table><tbody><tr><td>1,0 mL de spitz avec héparine</td><td>Greiner-bio-one</td><td>450534</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RPE (tampon de lavage #2 contenant de la guanidine et de l’éthanol dans un rapport de 1:4)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Wash buffer 2</td></tr><tr><td>Buffer RWT (tampon de lavage #1 contenant de la guanidine et de l’éthanol dans un rapport de 1:2)</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Wash buffer 1</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate pour qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>Plaque réactionnelle à 96 puits</td></tr><tr><td>MicroAmp Film adhésif optique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Film adhésif pour plaque réactionnelle à 96 puits</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p amorce</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3'miRNA-423-5p</td></tr> <tr><td>amorce</td><td>Qiagen</td><td>MS00012005</td><td>5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3'</td></tr><tr><td>miRNA-7218-5p amorce</td><td>Qiagen</td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -</td>3'miRNA-7219-5p</tr> <tr><td>amorce</td><td>Qiagen</td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3'miRNeasy</td></tr> <tr><td>Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Colonne de spin ancrée à membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td><td>Qiagen</td><td>217184</td><td>Colonne de spin ancrée à membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL</td></tr><tr><td>Kit RT miScript II (tampon de transcription inverse)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit de transcriptase inverse</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit PCR à base de colorant</td></tr><tr><td>vert QIA Broyeur QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Colonnes de spin en biopolymère dans un tube de collecte de 2,0 mL</td></tr><tr><td>Réactif de lyse QIAzol (lyse à base de phénol/guanidine réactif)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Réactif de lyse à base de phénol/guanidine</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Système de PCR en temps réel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Instrument de PCR en temps réel</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Logiciel d’instrument de PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 amorce</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Non divulgué pour des raisons de confidentialité</td></tr><tr><td>Souris mâles SAMP1</td><td>Nippon SLC Corporation</td><td>Non attribué</td><td></td></tr><tr><td>Souris mâles SAMR1</td><td>Nippon SLC Corporation</td><td>Non attribué</td><td></td></tr><tr><td>Biomasher Takara standard</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>Homogénéisateur de silicium</td></tr></tbody></table>

Évaluation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase de l’expression des microarn dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants composés de 21 à 25 bases. Ils ne sont pas traduits en protéines mais travaillent plutôt à entraver le fonctionnement de leurs ARN messagers cibles (ARNm) en les déstabilisant et en perturbant leur traduction. Bien que les profils d’expression des miARN dans divers organes et tissus de souris aient été étudiés, il n’existe pas de méthodes standard pour purifier et quantifier les miARN rénaux et sériques de souris. Nous avons établi une méthode efficace et fiable pour extraire et évaluer l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge. 
La méthode utilise la réaction en chaîne quantitative par transcription inverse et polymérase (qRT-PCR), et le protocole nécessite six étapes: (1) préparation de souris à résistance 1 accélérée par sénescence (SAMR1) et de souris sujettes à la sénescence (SAMP1); (2) extraire des échantillons de sérum de ces souris; 3° extraire un échantillon de rein de chaque souris; (4) extraire l’ARN total (y compris les miARN) des échantillons de rein et de sérum de chaque souris; (5) la synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc) avec transcription inverse à partir du miARN ; (6) effectuer une qRT-PCR en utilisant l’ADNc obtenu. 
Ce protocole a été utilisé pour confirmer que, par rapport aux témoins, l’expression de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p était significativement modifiée dans les reins et le sérum d’un modèle murin d’insuffisance rénale dépendante de l’âge. Ce protocole a également clarifié la relation entre le rein et le sérum du modèle murin d’insuffisance rénale liée à l’âge. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’expression des miARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale liée à l’âge.

Pour le modèle murin d’insuffisance rénale liée à l’âge, nous avons utilisé des souris mâles SAMP1 âgées de 50 semaines pesant entre 40 et 45 g. Environ 0,8 mL de sang a été recueilli par souris et transféré dans un tube à bec de 1,0 ml contenant de l’héparine, inversé et centrifugé. Chaque rein a été rincé avec du PBS, disséqué et stocké dans de l’azote liquide pour une analyse plus approfondie. Des souris SAMR1 âgées de cinquante semaines ont servi de témoins. Sur la base des données miARN qRT-PCR obtenues à l’aide de ce modèle d’insuffisance rénale dépendante de l’âge, nous avons observé que le taux rénal de miRNA-7219-5p était significativement augmenté et que le taux rénal de miRNA-7218-5p était considérablement diminué chez les souris SAMP1 par rapport aux témoins (Figure 1). Les taux sériques de miRNA-7219-5p et miRNA-7218-5p ont été considérablement augmentés chez les souris SAMP1 par rapport aux témoins (Figure 2). Les niveaux d’expression de miRNA-223-3p n’ont pas changé dans les deux souches et entre les reins et le sérum (Figure 1 et Figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> Figure 1 : MicroARN exprimés différentiellement dans les reins de souris SAMP1. Analyse qRT-PCR de l’expression de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p chez des souris SAMR1 (témoin, n = 4) et SAMP1 (n = 4). Les données sont des moyennes ± des erreurs-types (barres d’erreur); Les tests T ont été utilisés pour analyser les différences entre les groupes; p &lt; 0,05 a été jugé significatif (*p &lt; 0,05), n.-é. : non significatif. Abréviations : miARN = microARN ; SAMP1 = souris sujette à la sénescence accélérée; SAMR1 = résistance de souris accélérée par sénescence 1; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative de transcription inverse-polymérase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> Figure 2 : MiARN exprimés différentiellement dans le sérum de souris SAMP1. Analyse qRT-PCR de l’expression de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p chez les souris SAMR1 (témoin, n = 4) et SAMP1 (n = 4). Les données sont moyennes ± SE (barres d’erreur); Les tests T ont été utilisés pour étudier les différences significatives entre les groupes. *p &lt; 0,05 par test t. Abréviations : miARN = microARN ; SAMP1 = souris sujette à la sénescence accélérée; SAMR1 = résistance de souris accélérée par sénescence 1; qRT-PCR = transcription inverse-réaction en chaîne par polymérase <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">quantitative Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons une méthode d’évaluation de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge par réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse.

Évaluation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Cette méthode qRT-PCR peut répondre à des questions liées au profilage de l’expression des microARN dans le sérum de souris dans des conditions telles que l’insuffisance rénale dépendante de l’âge. La technique permet la détection de l’expression des microARN avec une grande précision et sensibilité par un processus simple qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs techniques. Pour commencer, incisez la peau de l’abdomen à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux chirurgicaux.Coupez les muscles de la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes. Soulevez la membrane péritonéale à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision latérale dans le bord supérieur avec des ciseaux chirurgicaux. Continuez l’incision le long du bord inférieur des côtes.Identifier la veine cave inférieure en utilisant deux cotons-tiges humidifiés au PBS. Insérez une aiguille de 30 G fixée à une seringue de 1 millilitre dans la veine cave inférieure et tirez la seringue. Retirez lentement l’aiguille pour éviter l’hémolyse.Transférer le sang dans un tube à bec de 1 millilitre avec de l’héparine et mélanger en inversant. Centrifuger le tube à bec pendant 10 minutes à 3000 fois G à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Prélevez 200 microlitres d’échantillon de sérum et ajoutez 1 000 microlitres de réactif de lyse à base de phénol/guanidine. Tourbillonner le mélange pendant 5 secondes et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Ajouter 200 microlitres de chloroforme et mélanger en retournant le tube 15 fois.Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 3 minutes, puis procéder à une centrifugation. Sans déranger la pastille, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter 450 microlitres d’éthanol à 100% et vortex le tube pendant 5 secondes.Ensuite, chargez 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de spin ancrée à membrane et centrifugez-la. Jetez le flux continu et ajoutez 700 microlitres de Wash Buffer 1 fourni dans le kit. Centrifuger à nouveau et jeter l’écoulement.Répétez le lavage avec 500 microlitres de Wash Buffer 2 pour éliminer les sels traces. Ajouter 500 microlitres d’éthanol à 80%, centrifuger et éliminer le flux continu du tube de collecte. Centrifugez à nouveau la colonne de spin et transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre.Ajoutez ensuite 14 microlitres d’eau sans RNase et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Faites tourner la colonne à nouveau pendant 1 minute à 15000 fois G à température ambiante. Préparer une solution de mélange principal et ajouter 8 microlitres par puits dans un tube à bande de 8 puits.Ajouter 12 microlitres de l’ARN total extrait dans chaque tube, et centrifuger le tube pendant 15 secondes à 2000 fois G à température ambiante. Placez le tube dans un cycleur thermique et commencez l’incubation pour synthétiser l’ADNc. Après l’incubation, transférer l’ADNc dans un nouveau tube microcentrifugeux.Diluer l’ADNc dix fois avec de l’eau distillée. Puis vortex, suivi d’une centrifugation pendant 5 secondes à 2000 fois G à température ambiante. Dans un tube à microcentrifugation, préparer la solution de mélange principal comme décrit dans le protocole de texte, et vortex la solution.Ajouter 22,5 microlitres aliquotes dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, suivis de 2,5 microlitres d’ADNc. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif et centrifugez la plaque pendant 30 secondes à 1000 fois G.Placez la plaque dans le système de PCR en temps réel. Modifiez les paramètres en fournissant un nom pour l’expérience.Sélectionnez ensuite 96 puits 0,2 millilitre comme type d’expérience, CT comparatif comme méthode de quantification, standard comme mode d’exécution du système et les réactifs SYBR Green comme réactifs pour détecter la séquence cible. Donnez les noms de l’échantillon et du miARN cible dans chaque puits. Attribuez des échantillons en double, choisissez un échantillon de référence et un témoin endogène, puis sélectionnez-en aucun pour le colorant à utiliser comme référence passive.Pour éliminer la contamination croisée des réactifs, configurez une transcriptase inverse négative et un contrôle sans modèle pour l’expression des miARN. Ensuite, assurez-vous que le volume de réaction est réglé à 20 microlitres et que les conditions de cycle PCR sont réglées à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis 40 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, recuit à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et extension à 70 degrés Celsius pendant 30 secondes. Une fois le processus terminé, cliquez sur analyser pour analyser les données qRT-PCR.Confirmez que la ligne de seuil automatiquement sélectionnée par le programme est appropriée pour chaque puits. Vérifier la valeur seuil du cycle du contrôle endogène et des miARN cibles analysés dans chaque échantillon. Déterminer les valeurs CT par l’intersection de la courbe d’amplification et de la ligne de seuil.Les données qRT-PCR miRNA pour le modèle d’insuffisance rénale dépendante de l’âge ont montré que, par rapport aux souris témoins SAMR1, le taux rénal de miRNA-7219-5p a significativement augmenté chez les souris expérimentales SAMP1, tandis que le niveau rénal de miRNA-7218-5p a diminué. Les niveaux d’expression de miRNA-223-3p n’ont changé dans aucune des souches. Les taux sériques de miRNA-7219-5p et miRNA-7218-5p ont considérablement augmenté chez les souris SAMP1, tandis que les niveaux de miRNA-223-3p sont restés inchangés.Vous devez insérer l’aiguille dans la veine cave inférieure et extraire le sang sans pénétrer dans le vaisseau. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le profilage de l’expression des microARN dans le sérum de souris pour un large éventail de conditions pathologiques.

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Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ optimisé pour la détection colorimétrique de l'expression de micro-ARN dans des sections de rein fixés au formol.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

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Cet article présente un protocole de détection de l’expression de microARN dans les reins d’un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse en temps réel. Ce protocole met l’accent sur un modèle murin d’insuffisance rénale ischémique et sur l’extraction minutieuse d’échantillons de microARN.

Méthode de détection quantitative de microARN dans le rein d’un modèle murin de lésion rénale ischémique

Nous décrivons une méthode pour évaluer l’expression de microARN dans les reins des souris avec l’obstruction ureterale unilatérale (UUO) par la réaction quantitative de la chaîne de transcription inverse-polymérase. Ce protocole convient pour étudier les profils d’expression de microARN de rein chez les souris avec UUO et dans le contexte d’autres conditions pathologiques.

Évaluation quantitative en temps réel du PCR des expressions microARN dans le rein de souris avec obstruction urérale unilatérale

Les microARN sont impliqués dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Nous avons développé une méthode fiable pour détecter les niveaux d’expression des microARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). Cette nouvelle méthode facilitera la vérification de l’implication des miARN dans la néphropathie à IgA.

Détection de l’expression de microARN dans les reins de souris néphropathiques immunoglobulines A

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Livraison d’un miARN exogène synthétisé artificiellement dans le rein à l’aide de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale

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Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

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Évaluation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge

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