Name: Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez la purification des canaux TRP endogènes de Drosophile par chromatographie d'affinité utilisant des billes de nickel. Cette méthode permet d'étudier les propriétés électrophysiologiques et la structure de ces canaux essentiels.

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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (n° 31870746), shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) et natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2021A1515010796) à W. L. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

1. Purification du TRP étiqueté GST et des fragments NORPA étiquetés His
<ol><li>Purifier le fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS<ol>
<li>Transformez le plasmide10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 en cellules Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu Luria Bertani (LB) et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier les 10 mL de culture d’ensemencement dans 1 L de milieu LB à 37 °C.</li>
		<li>Une fois que la densité optique (OD600) des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.</li>
		<li>Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 × g pendant 20 min et remettre en suspension dans 40 mL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS).</li>
		<li>Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression pré-refroidi à 4 °C. Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez le robinet d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes très étroites. REMARQUE: Les cellules sont homogénéisées par les forces de cisaillement élevées causées par une chute de pression et une cavitation importantes.</li>
		<li>Chargez 5 mL de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les billes avec 50 mL de tampon PBS pour un total de trois fois.</li>
		<li>Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée (40 mL) aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitaire et incuber pendant 30 min à 4 °C. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes.</li>
		<li>Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement. Rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 mL de tampon PBS.</li>
		<li>Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux billes de glutathion et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.</li>
		<li>Après 30 min d’incubation, éluez le fragment TRP 1261-1275 marqué GST dans un tube conique de 50 mL et chargez-le dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibré à l’aide d’un tampon Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir les protéines éluées à raison de 5 mL/tube.</li>
		<li>Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tachez le gel avec coomassie bleu R250.</li>
		<li>Concentrer le fragment purifié TRP 1261-1275 marqué GST de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.</li>
		<li>Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment TRP 1261-1275 marqué GST à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). En règle générale, la culture de 1 L de TRP 1261-1275 marqué GST donne 1 mL de 600 μM de protéines (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 1 pour les matériaux nécessaires.</li>
	</ol></li>
	<li>Purification du fragment NORPA 863-1095 étiqueté His<ol>
<li>Transformer le plasmide20 pETM.3C NORPA 863-1095 en cellules E. coli BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu LB et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier la culture d’ensemencement de 10 mL dans 1 L de milieu LB à 37 °C.</li>
		<li>Une fois que la DO600 des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’IPTG (concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.</li>
		<li>Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 x g pendant 20 min et remise en suspension dans 40 mL de tampon de liaison. Ensuite, lyser les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur à haute pression à 4 °C comme décrit à l’étape 1.1.4.</li>
		<li>Chargez 5 mL de billes de Ni dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez trois fois avec 50 mL de tampon de liaison.</li>
		<li>Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée aux billes de Ni équilibrées dans la colonne d’écoulement par gravité et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.</li>
		<li>Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement et lavez les billes de Ni restantes deux fois avec 50 mL de tampon de lavage.</li>
		<li>Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux ni-billes et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.</li>
		<li>Après 30 min d’incubation, recueillir le fragment NORPA 863-1095 marqué His élué dans un tube conique de 50 mL et charger dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibrée à l’aide de Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir la protéine éluée à raison de 5 mL/tube.</li>
		<li>Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tassez le gel à l’aide de Coomassie bleu R250.</li>
		<li>Concentrer le fragment NORPA 863-1095 purifié de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.</li>
		<li>Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment NORPA 863-1095 marqué his à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Typiquement, la culture de 1 L du fragment NORPA 863-1095 marqué par His donne 1 mL de 600 μM de protéine (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 2 pour les matériaux nécessaires.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation des têtes de drosophiles
<ol><li>Recueillir les mouches adultes dans des tubes de centrifugation conique de 50 mL à l’aide de la méthode d’anesthésie au CO2 22,23; congeler immédiatement dans de l’azote liquide pendant 10 min et conserver dans un congélateur à -80°C.</li>
	<li>Après avoir recueilli un nombre suffisant de mouches, secouez vigoureusement les tubes coniques congelés de 50 mL à la main pour séparer les pattes, la tête, les ailes et le corps des mouches. Transférer le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis séquentiellement (maillage 20/30/40, respectivement) et agiter les tamis.</li>
	<li>Ensuite, comme les têtes ne peuvent pas passer à travers le tamis à 40 mailles, utilisez une brosse pour balayer les têtes de mouche du tamis à 40 mailles, transférez-les dans des tubes coniques de 50 mL et stockez-les à −80 °C.</li>
	<li>Recueillir en permanence les mouches et leurs têtes et les stocker dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent la quantité requise pour l’expérimentation (0,5 g). En règle générale, pour recueillir 0,5 g de têtes, 35 mL de mouches dans un tube conique de 50 mL sont nécessaires. Voir le tableau 3 pour les matériaux nécessaires.</li>
</ol>3. Purification du canal TRP de la drosophile
<ol><li>Peser un total de 0,5 g de têtes et homogénéiser complètement dans l’azote liquide à l’aide d’un pilon de mortier pré-refroidi. Dissoudre les têtes homogénéisées dans un tampon de lyse de 10x v/w (5 mL), incuber dans un agitateur à 4 °C pendant 20 min, puis centrifuger à 20 817 x g pendant 20 min à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant de spin-down (« 20817 g S », Figure 4) et le centrifuger à 100 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Utilisez le surnageant de rotation (« 100 000 g S », figure 4) pour le test de traction suivant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de billes de Ni dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les billes avec 10 mL deH2O(ddH2O) double distillé à 4 °C pour un total de trois fois. Équilibrer les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse trois fois à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine NORPA 863-1095 purifiée marquée His-1095 (3 x 10-7 mol) dans la colonne Ni et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.</li>
	<li>Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction de flux. Prenons la fraction de flux pour l’analyse SDS-PAGE (NORPA F, Figure 4). Dans cette section, les protéines d’appât sont immobilisées sur les perles de Ni.</li>
	<li>Lavez les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et conservez la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 1, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et conservez l’échantillon pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 2, Figure 4A). Dans cette section, les protéines d’appât excessives sur les perles de Ni sont éliminées.</li>
	<li>Ajouter le surnageant de l’homogénat de tête de drosophile après centrifugation de 100 000 x g dans la colonne Ni à 4 °C, où le fragment NORPA 863-1095 marqué par His a été immobilisé.</li>
	<li>Incuber le surnageant avec les perles de Ni à 4 °C pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes. Ensuite, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.</li>
	<li>Recueillir le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (lyse de tête Dro F, Figure 4A). Dans cette section, les complexes protéiques INAD (INAD/TRP/ePKC) dans les homogénats de tête sont capturés par les fragments NORPA 863-1095 immobilisés sur les ni-billes.</li>
	<li>Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et garder le surnageant des précipitations par gravité pour l’analyse SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et collectez le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 4, Figure 4A). Dans cette section, les protéines non liées sur les perles de Ni sont éliminées.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine TRP 1261-1275 marquée GST (3 x 10-7 mol) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.</li>
	<li>Recueillir la fraction éluée de la colonne de gravité (TRP E1, Figure 4B), qui contient le canal endogène Drosophila TRP. Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (TRP E2, Figure 4B). Dans cette étape, en utilisant les fragments TRP 1261-1275 marqués GST comme concurrent, les canaux TRP sont élués à partir des complexes protéiques INAD capturés (INAD / TRP / ePKC) sur les perles Ni.</li>
	<li>Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison (10 mL; Tableau 1) à 4 °C et recueillir la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 5, Figure 4B).</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon d’élution (tableau 1) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Recueillir la fraction d’élution de la colonne d’écoulement gravitaire (NORPA E1, figure 4B). Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (NORPA E2, Figure 4B).</li>
	<li>À l’aide du tampon d’élution, éluez le fragment NORPA 863-1095 marqué His accompagné des complexes protéiques INAD/ePKC. Ensuite, remettez en suspension les billes de Ni dans 500 μL de tampon de liaison.</li>
	<li>Prenez les billes de Ni remises en suspension pour exécuter la SDS-PAGE (colorée par Coomassie bleu R250) afin d’analyser l’efficacité de l’élution et d’évaluer si le tampon d’élute fonctionne (perles, Figure 4B). Voir le tableau 4 pour les matériaux nécessaires.</li>
</ol>4. Purification de la colonne d’exclusion de taille du canal TRP de la drosophile
<ol><li>Installez une colonne d’exclusion de taille (grade analytique) sur le système de purification des protéines. Équilibrez la colonne avec le tampon de colonne (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), qui est filtré par un filtre de 0,45 μm.</li>
	<li>Concentrer la fraction TRP E1 et E2 de l’étape 3.14 à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 4 mL, centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée.</li>
	<li>Rincez la boucle d’échantillon avec le tampon de colonne et chargez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit approprié (0,5 mL/min).</li>
	<li>Identifier le pic de la protéine cible par absorption à 280 nm et exécuter un gel SDS-PAGE pour détecter le canal endogène purifié de la Drosophile TRP (Figure 5). Voir le tableau 5 pour les matériaux nécessaires.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
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<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
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<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

INAD, qui contient cinq domaines PDZ, est le principal organisateur des machines de phototransduction de la drosophile. Des études antérieures ont montré que INAD PDZ3 se lie à la queue C-terminale du canal TRP avec une spécificité exquise (KD = 0,3 μM)18. Le tandem INAD PDZ45 interagit avec le fragment NORPA 863-1095 avec une affinité de liaison extrêmement élevée (KD = 30 nM). Ces résultats fournissent une base biochimique solide pour concevoir la stratégie de puri...

La phototransduction est un processus où les photons absorbés sont convertis en codes électriques des neurones. Il relaie exclusivement les opsines et la cascade de signalisation couplée à la protéine G suivante chez les vertébrés et les invertébrés. Chez la drosophile, en utilisant ses cinq domaines PDZ, l’inactivation de la protéine d’échafaudage sans potentiel postérieur D (INAD) organise un complexe de signalisation supramoléculaire, qui se compose d’un canal de potentiel de récepteur transitoire (TRP), de potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA) et d’une protéine kinase C (ePKC)1 spécifique à l’œil. La formation de ce complexe de signalisation supramoléculaire garantit la localisation subcellulaire correcte, une efficacité élevée et la spécificité de la machinerie de phototransduction de la drosophile. Dans ce complexe, les canaux TRP sensibles à la lumière agissent comme des effecteurs en aval de NORPA et médient l’afflux de calcium et la dépolarisation des photorécepteurs. Des études antérieures ont montré que l’ouverture du canal TRP de la drosophile est médiée par les protons, la perturbation de l’environnement lipidique local ou la force mécanique 2,3,4. Le canal TRP de la drosophile interagit également avec la calmoduline5 et est modulé par le calcium par rétroaction positive et négative 6,7,8.
Jusqu’à présent, les études d’électrophysiologie sur le mécanisme de contrôle des canaux TRP et TRP-like (TRPL) de la drosophile étaient basées sur des patchs membranaires excisés, des enregistrements de cellules entières de photorécepteurs dissociés de type sauvage de la drosophile et des canaux hétéro-exprimés dans les cellulesS2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mais pas sur les canaux purifiés. Les informations structurelles du canal TRP complet de la drosophile restent également floues. Afin d’étudier les propriétés électrophysiologiques des protéines purifiées dans un environnement membranaire reconstitué et d’obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de drosophile sur toute la longueur, l’obtention de canaux TRP purifiés sur toute la longueur est la première étape nécessaire, similaire aux méthodologies utilisées dans les études des canaux TRP des mammifères 14,15,16,17.
Récemment, sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD 18,19,20, une stratégie de purification d’affinité et de compétition a d’abord été développée pour purifier le canal TRP des homogénats de tête de drosophile par des billes de streptavidine 5. Compte tenu de la faible capacité et du coût élevé des perles de streptavidine, un protocole de purification amélioré est introduit ici qui utilise la protéine d’appât marquée His et les perles Ni correspondantes à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée. La méthode proposée aidera à étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP sous des angles structurels et à mesurer les propriétés électrophysiologiques du canal TRP avec des protéines purifiées.

<table><tbody><tr><td><fortes>souches bactériennes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Cellules compétentesNovagen</td><td></td> <td>69450</td><td>Surexpression des protéines</td></tr><tr><td><fortes>Modèles d’expérience</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster : W1118 souche</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC :3605</td><td>Drosophila préparation de la tête</td></tr><tr><td><fort>Matériel</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 tamis en acier inoxydable</td><td>Jiufeng metal mesh company</td><td>GB/T6003.1</td><td>Drosophila préparation de la tête</td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-N,N&prime ;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>Préparation de gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>Préparation de gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>Coloration de gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Préparation</td></tr> <tr><td>de tampon de colonne d’exclusion stériqueSel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500 Préparation de</td><td>tampon de colonne d’exclusion stérique</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>Préparation de tampon SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Glutathion Sepharose 4 Perles à écoulement rapide</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Chromatographie d’affinité</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Tampon d’élution préparation pour colonne de nickel</td></tr><tr><td>Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Induction de la surexpression des protéines</td></tr><tr><td>LB Poudre de bouillon</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-Glutathion réduit (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Préparation du tampon d’élution pour billes</td></tr> <tr><td>de glutathionBilles de Ni-Sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Chromatographie d’affinité</td></tr><tr><td>N-Dodecyl bêta-D-maltoside (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Détergent pour la purification des protéines</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE préparation de gel</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Tampon d’homogénéisation pour <>E.coli.</td></tr><tr>cellule<td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Marqueur protéique précoloré Thermo</td><td>Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Échelle de protéines précolorées</td></tr><tr><td>Colonne d’exclusion de taille (grade de préparation)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 Colonne PG</td></tr><tr><td>Colonne d’exclusion de taille (grade analytique)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 Colonne GL</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Préparation de tampon de purification de</td></tr><tr><td>protéines Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>Préparation de gel/tampon SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Préparation de tampon de purification de protéines Spin</td></tr> d’ultrafiltration <tr><td> colonne</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Concentration en protéines</td></tr><tr><td><fort>équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Mètre de Drosophila tête</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse de bureau pour tubes de centrifugation coniques de 15 ml et 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Concentration en protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse de bureau Tubes de centrifugation de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Centrifugation du lysat de tête Drosophila après homogénéisation</td></tr><tr><td>Colonne d’écoulement par gravité vide (diamètre intérieur = 1,0 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>Purification des protéines TRP</td></tr><tr><td>Colonne d’écoulement par gravité vide (diamètre intérieur = 2,5 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Purification des appâts et des protéines concurrentes à partir de E.coli.</td></tr><tr><td>Gel Système</td><td>de documentation Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR</td><td>Système SDS-PAGE imagerie Centrifugeuse</td></tr><tr><td>réfrigérée à grande vitesse</td><td>Beckman Soc</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrifugation des cellules E.coli./lysat cellulaire</td></tr><tr><td>Homogénéisateur haute pression</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogénéisation des cellules E.coli.</td></tr><tr><td>Réservoir d’azote liquide</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Préparation de la tête </td></tr><tr><td>Épurateur de</td><td>protéines</td><td>Cytiva</td> AKTA <td>Purification des protéines</td></tr><tr><td>Réfrigérateur (-80&deg ; C)</td><td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Préparation de la tête drosophile</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 Mesure des cellules E.coli.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Détermination de la concentration en protéines</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td><td>Ultracentrifugation</td></tr></tbody></table>

purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

La phototransduction de la drosophile est l’une des voies de signalisation couplées à la protéine G les plus rapides connues. Pour assurer la spécificité et l’efficacité de cette cascade, le canal cationique perméable au calcium (Ca2+), le potentiel récepteur transitoire (TRP), se lie étroitement à la protéine de l’échafaudage, l’inactivation sans potentiel Après potentiel D (INAD), et forme un grand complexe protéique de signalisation avec la protéine kinase C (ePKC) spécifique à l’œil et le potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA). Cependant, les propriétés biochimiques du canal TRP de la drosophile restent floues. Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, une purification d’affinité modifiée et une stratégie de compétition ont été développées pour purifier le canal endogène TRP. Tout d’abord, le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué à l’histidine (His) a été lié à des perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire le complexe protéique endogène de l’INAD des homogénats de tête de drosophile. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 purifié excessif marqué par la glutathion S-transférase (GST) a été ajouté aux perles de Ni pour concurrencer le canal TRP. Enfin, le canal TRP dans le surnageant a été séparé du peptide TRP 1261-1275 excessif par chromatographie d’exclusion de taille. Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP de la drosophile sous des angles biochimiques et structurels. Les propriétés électrophysiologiques des canaux TRP purifiés de la drosophile peuvent également être mesurées à l’avenir.

Dans cet article, il est démontré qu’une méthode de purification des protéines purifie le canal endogène TRP de la drosophile (Figure 1).
Tout d’abord, l’expression et la purification des protéines recombinantes sont appliquées pour obtenir les protéines d’appât et concurrentes. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 marqué GST est exprimé dans des cellules E. coli BL21 (DE3) en milieu LB et purifié à l’aide de billes de glutathion et d’une colonne d...

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Dans ce protocole, nous démontrons le processus de purification pour obtenir des canaux TRP purifiés sur toute la longueur, ce qui est la première étape nécessaire pour étudier les propriétés électrophysiologiques et obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de la drosophile sur toute la longueur. Sur la base du mécanisme d’échantillonnage du complexe protéique INAD et en utilisant des billes de nickel à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée, une quantité suffisante de canaux TRP peut être purifiée des têtes de mouche. Yuyang Liu, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, transformez le plasmide pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 en cellules E. coli BL21, en utilisant la méthode de transformation par choc thermique au chlorure de calcium. Inoculer une seule colonie dans 10 millilitres de milieu Luria Bertani et croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ajouter les 10 millilitres de culture d’ensemencement dans un litre de milieu Luria Bertani et incuber à 37 degrés Celsius.Une fois que la densité optique des cellules atteint 0,5, refroidissez les cellules à 16 degrés Celsius et ajoutez 0,1 millimolaire isopropyl-bêta-D-1-thiogalactopyranoside. Après surexpression, pastillez un litre de cellules cultivées par centrifugation et remettez en suspension dans 40 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression, pré-refroidi à quatre degrés Celsius.Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez la languette d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes étroites. Chargez cinq millilitres de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les perles avec 50 millilitres de tampon salin tamponné au phosphate, pour un total de trois fois.Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48, 384 fois G.Ajouter environ 40 millilitres du surnageant du lysat de cellule centrifugé aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitationnel, et incuber pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes. Après 30 minutes d’incubation, ouvrez la languette de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.Jetez la fraction d’écoulement et rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 millilitres de tampon salin tamponné au phosphate. Ajouter 15 millilitres de tampon d’élution aux perles de glutathion et remettre les perles en suspension toutes les 10 minutes. Eluter le fragment TRP 1261-1275 étiqueté GST dans un tube conique de 50 mL et le charger dans une colonne d’exclusion de taille.Recueillir cinq millilitres de protéines éluées par tube et concentrer les fragments purifiés à un millilitre par centrifugation dans une colonne de spin d’ultrafiltration dans une centrifugeuse réfrigérée. Pour purifier le fragment NORPA 863-1095 étiqueté His, suivez la procédure précédemment démontrée à l’aide de perles de nickel. Recueillez les mouches adultes dans des tubes de centrifugeuse coniques de 50 millilitres et congelez-les dans de l’azote liquide pendant 10 minutes.Secouez vigoureusement les tubes congelés à la main et transférez le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis empilés séquentiellement. Secouez les tamis et balayez les têtes de mouche du tamis à 40 mailles à l’aide d’une brosse. Transférez-les dans des tubes coniques de cinq millilitres et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.Homogénéiser 0,5 gramme de têtes dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon pré-refroidis. Dissoudre les têtes homogénéisées dans cinq millilitres de tampon de lyse 10X, suivie d’une centrifugation à 20, 817 fois G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Le surnageant de rotation est en outre centrifugé 100 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes.Ajouter un millilitre de billes de nickel dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les perles trois fois avec 10 millilitres d’eau double distillée à quatre degrés Celsius. Équilibrez les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse, trois fois à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de 600 micromolaires purifiés de la protéine NORPA 863-1095 purifiée dans la colonne de nickel et incuber la colonne.Remettez enseveli les perles toutes les 10 minutes. Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les billes et la fraction traversante, et lavez les billes de nickel avec 10 millilitres de tampon de lyse à froid. Ensuite, ajoutez un surnageant froid de l’homogénat de tête de drosophile dans la colonne de nickel.Après l’incubation, lavez les billes avec 10 millilitres de tampon de lyse et ajoutez 500 microlitres de 600 micromolaires de protéine tRP 1261-1275 marquées GST dans les perles. Collectez la fraction éluée de la colonne de gravité. Lavez les billes de nickel avec 10 millilitres de tampon de liaison.Ensuite, ajoutez un tampon d’élution et collectez la fraction d’élution de la colonne d’écoulement par gravité. Concentrez les fractions éluées de la purification du canal TRP de la drosophile, à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de quatre millilitres. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit raisonnable.Le fragment TRP 1261-1275 marqué GST a été exprimé dans des cellules E. coli et purifié à l’aide de perles de glutathion et d’une colonne d’exclusion de taille. De même, le fragment NORPA 863-1095 marqué his a été exprimé et purifié à l’aide de billes de nickel et d’une colonne d’exclusion de taille. Le canal TRP élué est séparé du peptide TRP 1261-1275 marqué GST excessif, par chromatographie d’exclusion de taille.En tant que sous-produit, les complexes INAD, ePKC, NORPA 863-1095 sont obtenus après la compétition peptidique TRP 1261-1275. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est d’homogénéiser les têtes de mouches dans de l’azote liquide et de résoudre l’homogénat dans un tampon contenant un détergent appelé DDM. En suivant cette procédure, nous pouvons également purifier l’ensemble du complexe protéique INAD qui peut être utilisé pour étudier ses mécanismes d’assemblage et de régulation.Une application future potentielle de cette méthode consistera à étudier l’information structurelle du canal TRP endogène de la drosophile à l’aide des techniques Cryo-EM. En outre, il est également possible de mesurer les propriétés électrophysiologiques des canaux endogènes purifiés de la Drosophile TRP dans la membrane lipidique bicouche artificielle.

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