Évaluation fonctionnelle de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes à l’aide de l’inhibition in vivo , de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux

La méiose est un événement évolutif conservé chez les eucaryotes, essentiel à la gamétogenèse et à la reproduction sexuée. Notre protocole fournit une méthode efficace pour les études de la division méiotique et de la spermatogenèse. Nous avons décrit une série de protocoles pour l’analyse des spermatocytes.

Cette technique peut être appliquée pour l’observation du fuseau méiotique, des chromosomes homologues et des organites subcellulaires dans les spermatocytes. Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse de la division méiotique, la génération de modèles animaux d’édition de gènes et la transfection de gènes dans des tissus ou des organes. Les expérimentateurs doivent maintenir un environnement stérile pendant la chirurgie abdominale et prêter attention à la température, au temps et aux conditions expérimentales clés de ce protocole.

La démonstration de la procédure sera Mlle Meng-Fei Xu, une diplômée de mon laboratoire. Commencez la construction du modèle murin d’inhibition de la protéine centromère E médiée par la GSK923295 ou le CENP-E en attachant les membres de souris anesthésiés et en les fixant sur le plateau de cire. Après avoir désinfecté la zone chirurgicale, utilisez un scalpel stérile pour faire une ouverture de cinq millimètres dans la cavité abdominale de la souris, puis placez des pinces chirurgicales stériles sur la peau.

Ensuite, tirez le coussinet adipeux épididymaire avec une pince à dissection stérile pour localiser les testicules à l’aide d’une pince à épiler stérile. Après avoir fixé les testicules avec des pinces stériles sous un stéréoscope, injectez lentement 10 microlitres de GSK923295 dans des tubules séminifères à une concentration finale de 10 micromolaires en utilisant 10 microlitres de Riodine. Lorsque cela est fait, repoussez les testicules dans la cavité abdominale et suturez le site chirurgical comme décrit dans le manuscrit du texte.

Pour la déshydratation par gradient des testicules de souris collectés, incuber séquentiellement l’échantillon dans divers milieux comme décrit dans le manuscrit. Après l’incubation en série, placez le tissu au fond de la boîte d’incorporation et ajoutez la paraffine fondue dans la boîte. Pour la solidification complète de la paraffine, refroidir les échantillons à quatre degrés Celsius pendant six heures.

Plus tard, fixez l’échantillon sur le support de l’ultra microtome tout en gardant l’angle entre l’échantillon et la surface du couteau à 5 à 10 degrés. Ajustez l’épaisseur de la tranche à cinq micromètres pour préparer les sections de cinq micromètres d’épaisseur à l’aide d’un ultra microtome. Lors de la préparation, étaler la lame d’échantillon dans un bain-marie à 40 degrés Celsius avant de sécher les sections dans le séchoir à lames pendant 12 heures à 37 degrés Celsius.

Après 12 heures, effectuez une incubation séquentielle des lames comme expliqué précédemment. Ensuite, rincez les lames dans de l’eau distillée pendant cinq minutes, puis colorez avec la solution d’hématoxyline de Mayer pendant six minutes à température ambiante. Rincez ensuite les lames tachées à l’eau courante pendant cinq minutes et incuber avec de l’eau distillée pendant deux minutes.

Incuber les lames dans du chlorhydrate d’éthanol à 1% pendant trois secondes, puis rincer et faire couler à l’eau courante pendant deux minutes. Colorer l’échantillon avec 1% d’éosine pendant 15 secondes, suivi d’une incubation en série. Lorsque vous avez terminé, scellez les lames à l’aide de 15 microlitres de gomme neutre et d’une glissière de 24 par 50 millimètres.

Pour l’immunofluorescence, placer la lame dans la solution de récupération de l’antigène pour faire bouillir sous haute pression dans un autocuiseur pendant quatre minutes pour l’élimination de l’antigène. Ensuite, refroidissez naturellement la lame à température ambiante avant de rincer deux fois avec de l’eau distillée pendant cinq minutes et avec du PBS pendant cinq minutes. Pour perméabiliser les cellules, incuber la lame dans 500 microlitres de 0,25% Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes, puis rincer les lames avec du PBS pendant cinq minutes trois fois.

Pour le blocage de l’antigène, incuber l’échantillon avec 300 microlitres d’albumine sérique bovine à 3% ou BSA pendant une heure et avec les anticorps primaires dans 3% BSA dans PBST pendant 16 heures à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, placez la lame dans une boîte humidifiée pour éviter que les tissus ne se dessèchent. Réchauffez les lames naturellement à température ambiante pendant 30 minutes.

Jetez l’anticorps primaire, puis rincez la lame dans PBST pendant cinq minutes trois fois. Diluer les anticorps secondaires avec 3% BSA et PBST. Incuber ensuite l’échantillon avec des anticorps secondaires dilués pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius.

Après avoir rincé l’échantillon dans PBST pendant cinq minutes cinq fois, colorer les noyaux avec 50 microlitres DAPI pendant cinq minutes à température ambiante. Montez le couvercle avec le support de montage anti-décoloration et scellez le couvercle avec du vernis à ongles. Pour la cytométrie en flux, recueillir des testicules de souris dans des boîtes de Petri de six centimètres et couper les testicules en morceaux d’un millimètre cube à l’aide de ciseaux chirurgicaux.

Ensuite, digérez les testicules dans un millilitre de collagénase à 1% dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pour précipiter les cellules spermatogènes, centrifuger l’échantillon à 1 000 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant avant d’ajouter un millilitre de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine dans l’échantillon pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Plus tard, centrifuger l’échantillon à 1 000 G pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant pour incuber les cellules précipitées avec un millilitre d’éthanol froid à 70% pendant plus de huit heures à quatre degrés Celsius. Après centrifugation à 1 000 G pendant cinq minutes, recueillir les sédiments cellulaires et colorer les cellules spermatogènes avec 500 microlitres d’iodure de propidium ou de solution de coloration PI à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, filtrer l’échantillon à l’aide d’un écran de 300 mailles pour éliminer les débris cellulaires et recueillir les cellules dans un tube d’écoulement pour stocker les cellules à quatre degrés Celsius.

Détectez les signaux de fluorescence et la diffusion de la lumière à la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres à l’aide d’un cytomètre en flux. Analysez la teneur en ADN de l’échantillon et la diffusion de la lumière à l’aide du logiciel ModFit MF LT 32. Après l’injection testiculaire de GSK923295, l’onde spermatogène a été modifiée dans les tubules séminifères en raison de l’inhibition de la CENP-E.

Cependant, l’onde spermatogène dans les tubules séminifères était régulière et organisée dans le groupe témoin. Il a été observé que les différents chromosomes homologues n’étaient pas alignés sur la plaque équatoriale après l’inhibition de la CENP-E. De plus, l’inhibition de la CENP-E a conduit à l’augmentation des spermatocytes de métaphase I dans les tubules séminifères.

L’analyse d’immunofluorescence a démontré la diminution du nombre de cellules positives à la protéine complexe anti-synaptonémique trois ou SYCP3 positives par tubule séminifère après inhibition de la CENP-E. D’autre part, les points SYP3 par cellule métaphase et les étirements SYP3 par cellule n’ont pas été affectés dans les groupes GSK92395. Les distances des pôles de fuseau dans les spermatocytes de métaphase I ont été augmentées en raison de l’inhibition de la CENP-E.

L’analyse représentative démontre que l’inhibition de la CENP-E a entraîné une diminution des cellules haploïdes dans le groupe 923295 GSK par rapport au groupe témoin. Les rapports des cellules diploïdes et des cellules aneuploïdiques n’ont pas été significativement influencés après l’inhibition de la CENP-E. Inversement, les rapports des cellules tétraploïdes ont augmenté dans le groupe GSK923295 que dans le groupe témoin.

L’analyse par microscopie électronique à transmission des cellules spermatogènes a montré l’organisation perturbée des cellules spermatogènes dans le groupe GSK923295. L’expérimentateur doit faire attention à la position d’injection, à la dose de médicament, à la méthode d’injection et à la méthode de suture pendant la chirurgie abdominale et l’injection testiculaire. Cette technique associée à l’électroporation in vivo axée sur les protéines ciblées et les outils d’édition de gènes peut être utilisée dans le domaine de la division miotique et de la spermatogenèse.