Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

C’est un protocole simple et rapide qui permet aux personnes peu familières avec les cyanobactéries d’isoler facilement le phycobilisome. L’avantage de cette technique est qu’elle est adaptée à une petite échelle et qu’elle est facile à réaliser. Il s’agit d’une méthode simple, fiable et efficace pour isoler les phycobilisomes intacts des cynobactéries modèles et non modèles.

Commencez par transférer la culture cellulaire de 0,8 OD à 750 nanomètres dans une fiole d’un litre et diluez-la dans 500 millilitres de milieu B-HEPES pour obtenir la DO de 0,2 à 750 nanomètres. Cultivez la culture en remuant constamment à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la DO atteigne 0,8 à 1, indiquant une phase de croissance exponentielle tardive. Centrifuger la culture à une vitesse de 10 000 fois g pendant 20 minutes à température ambiante et jeter le surnageant.

Suspendez les granulés cellulaires et lavez-les deux fois avec un tampon de phosphate de potassium molaire de 0,75, pH sept. Granulés les cellules dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres par centrification à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire.

Mesurez le poids humide de la pastille à l’aide d’une balance électronique et remettez en suspension le gramme de poids humide de la pastille dans cinq millilitres du tampon. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire et 0,4 à 0,6 gramme de billes de verre de 0,1 millimètre dans un flacon à bouchon à vis de deux millilitres. Cassez les cellules pendant 30 secondes à l’aide d’un batteur de perles.

Laissez les tubes refroidir dans un bain-marie à température ambiante pendant deux minutes. Après lyse, centrifuger les flacons pendant 10 secondes à température ambiante à une vitesse de 500 fois g. Recueillir le surnageant avec une pipette dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.

Lavez les billes avec 0,5 millilitre de tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire une fois, puis transférez-les dans le même tube de centrifugeuse. Ajouter triton X-100 à la suspension à cellules lysées et incuber sur un agitateur à bascule à température ambiante et à 40 tr/ min pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Centrifugez les tubes pendant 20 minutes à 17, 210 fois g et stockez le surnageant sans la couche supérieure de micelle Triton à température ambiante jusqu’à une heure.

Faire quatre concentrations de saccharose dans un tampon de phosphate de potassium molaire de 0,75 à pH sept. Placer 2,8 millilitres de tampon de saccharose à deux molaires au fond du tube de centrifugeuse de 40 millilitres et superposer avec trois couches de solutions de saccharose. Enfin, ajoutez trois millilitres de PBS contenant la fraction surnageante et centrifugez les gradients résultants.

Lors de l’ultracentrification, condenser les PBS et les phycobiliprotéines fractionnées entre les couches et observer les bandes bleues dans Syn6803 et les interfaces. Éliminer le saccharose en concentrant et en diluant à plusieurs reprises les fractions avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire et en membrasant les unités de filtration centrifuges. Pour mesurer la fluorescence PBS, diluez l’échantillon concentré de PBS avec un tampon de phosphate de potassium de 0,75 molaire pour obtenir jusqu’à 500 microlitres de volume.

Ajouter l’échantillon de PBS dilué dans un tube en verre transparent et congeler le tube dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit entièrement congelé. Déplacez le tube congelé dans un récipient transparent prérempli d’azote liquide. La lyse cellulaire complète montre la couleur surnageante et bleu-vert foncé avant la centrification.

La séparation du gradient de densité de saccharose du PBS isolé montre plusieurs fractions de phycobiliprotéines dissociées et la fraction la plus faible représente le PBS intact. Les spectres d’absorption du PBS dissocié et intact de JSC one et Syn6803 ont le même pic à 622 nanomètres, correspondant à la phycocyanine. De plus, le pic d’absorption de la phycoérythrine à 571 nanomètres dans le PBS dissocié et intact de JSC-1.

Les spectres d’émission du PBS dissocié ont un pic fort à environ 650 nanomètres dans Syn6803 et JSC-1, représentant l’émission de phycocyanine. Les pics maximaux d’émission fluorescente à 651 nanomètres et 684 nanomètres révèlent que l’énergie récoltée par la phycocyanine a été transférée efficacement à l’allophycocyanine et aux émetteurs terminaux, qui sont ApcD et ApcE, dans le noyau. La figure montre SDS-PAGE coloré en zinc sous irradiation UV où les sous-unités phycobiliprotéiques sont fortement fluorescentes et l’ApcE a montré une faible fluorescence, indiquée par la flèche.

La coloration bleue de Kumasi montre que les fractions supérieures contiennent d’autres protéines solubles dans l’eau non PBS et que les PBS et Syn6803 intacts montrent une bande ApcE proéminente, indiquée par une flèche, dépourvue des fractions PBS dissociées. L’ultracentrifugation démontre que le gradient de saccharose préparé à un rapport de 1:3 affiche des bandes plus larges que le gradient fait à un rapport de 1:10. Il est important de lyser complètement les cellules et de solvolyser complètement les surnageants pour obtenir plus de phycobilisomes.

D’autres méthodes, comme la cryo-EM ou la spectrométrie mixte, peuvent être utilisées pour étudier la structure protéique ou la composition protéique des phycobilisomes.