Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

Ce protocole démontre une méthode de modification génétique in vitro simple pour l’étude moléculaire de la voie de signalisation primaire dépendante du cilium dans les cultures de précurseurs de cellules granulaires primaires. En raison du coût, de la faible viabilité et de la faible efficacité de la méthode de transfection actuelle, nous introduisons une technique d’électroporation simple, rentable et efficace pour étudier la voie de signalisation dépendante du cilium dans les cultures de BPC primaires. Pour commencer, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture de 24 puits contenant des feuillets de couverture enduits et maintenez-le au chaud à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone.

Pipeter le nombre requis de cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre et tourner à 200x G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres d’Opti-MEM. Répétez cette procédure deux fois pour vous assurer qu’aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le tube.

Définissez les paramètres d’électroporation comme indiqué. Pipettez doucement la réaction d’électroporation pour bien mélanger et utilisez une longue pointe de pipette P200 pour transférer un volume exact de 100 microlitres du mélange dans la cuvette à espace de deux millimètres. Une fois que la cuvette est à l’intérieur de la chambre de la cuvette, appuyez sur le bouton oméga de l’électroporateur et notez la valeur d’impédance en adhérant à un volume précis de 100 microlitres.

La plage de valeur d’impédance doit être d’environ 30 et 35. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer l’impulsion. Enregistrez les valeurs actuelles mesurées en joules affichées sur le cadre de lecture.

Retirez la cuvette de la chambre. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de milieu de culture préchauffé dans la cuvette et remettez-la en suspension en pipetant deux à trois fois. Transférer immédiatement la suspension cellulaire dans la plaque de 24 puits préalablement préparée.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone. Observez les cellules au microscope à fluorescence le lendemain. Dans la présente étude, l’efficacité de l’électroporation des groupes traités par DMSO et SAG semblait comparable.

L’immunocoloration du marqueur primaire du cil Arl13b démontre que le taux de ciliation du GCP à la div-2 de la culture dans les groupes traités par le véhicule et le SAG. Le taux de ciliation illustre le pourcentage de Pax6 exprimant des GCP portant un cilium primaire à la surface de la cellule à div-2 après l’électroporation. La figure montre une augmentation significative de la localisation lissée de l’EGFP sur l’axoneme primaire du cilium des cellules GCP d’expression Pax6 24 heures après le traitement SAG, indiquant une activation profonde de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium.

Afin d’obtenir une efficacité d’électroporation plus élevée, il faut assurer une grande pureté du plasmide utilisé et aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le mélange d’électroporation plasmidique. Ce protocole devrait être directement applicable et bénéfique pour les expériences de modification génétique in vitro sur des cultures primaires et des types de cellules difficiles à transfecter, y compris les neurones et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.