Génération d’un modèle Hook Ischemia-Reperfusion à l’aide d’un embryon de poussin en développement de trois jours

Bonjour, je suis le Dr Syed Shadab Raza, chercheur principal du Laboratoire de cellules souches et de neurologie réparatrice, situé au Département de biotechnologie du campus de l’Université Era, à Lucknow, en Inde. Dans mon laboratoire, nous nous efforçons de comprendre le mécanisme physiopathologique sous-jacent aux troubles de l’ischémie-reperfusion et les interventions qui peuvent inverser ces processus. Dans ce contexte, nous utilisons fréquemment le modèle in vitro et in vivo de l’AVC ischémique.

Récemment, nous avons créé un modèle de lésion ischémique-reperfusion dans un embryon de poussin en développement de trois jours. Alors maintenant, mes étudiants vont vous montrer comment reproduire la lésion d’ischémie-reperfusion dans un embryon de poussin en développement de trois jours. Maintenant, nous allons vous montrer comment créer une ischémie-reperfusion dans un embryon de poussin de trois jours.

Notre modèle est rentable, rapide et hautement reproductible. Alors commençons. Premier jour.

Exigences pour le premier jour. Procédure. Nettoyez l’œuf zéro jour avec 70% d’éthanol à l’aide de lingettes en papier de soie. Ensuite, écrivez le jour en cours, la date, sur les œufs avec le marqueur OHP, puis placez les œufs dans un incubateur à œufs avec une température de 36 à 37 degrés centigrades et une humidité de 60 à 65%.

Incuber les œufs pendant les 24 heures suivantes. Deuxième jour. Exigences pour le deuxième jour. Procédure.

Essuyez le ciseau chirurgical avec de l’éthanol à 70% ou suivi d’un autoclave. Après 24 heures d’incubation, retirez l’œuf de l’incubateur pour le superposer. Ensuite, attachez un petit morceau de Sellotape d’environ un pouce de longueur et de largeur au bord de l’œuf, puis faites un petit trou dans le bord de la coquille d’œuf à l’aide du ciseau à bord pointu suivi de l’insertion d’une seringue de cinq mL à un angle d’environ 75 degrés.

Après avoir inséré l’aiguille dans le sac vitellin, retirez lentement cinq à six ml d’albumine. Après avoir retiré l’albumine, refermez le trou avec du Sellotape et remettez l’œuf dans l’incubateur à œufs de 37 degrés Centigrade pendant les 48 heures suivantes. Quatrième jour.

Exigences pour le quatrième jour. Procédure. Préparez la solution de Ringer, une solution saline normale à 0,9 % et une solution saline tampon X phosphate selon les tableaux fournis dans ce manuscrit. Ensuite, autoclavez les trois solutions.

Après l’autoclave, les solutions respectives peuvent être placées à température ambiante. Ensuite, sortez l’œuf de l’incubateur à œufs à 37 degrés. Maintenant, avant de couper la coquille, couvrez la zone de fenêtrage avec Sellotape.

Et maintenant, faites un petit trou sur la coquille d’œuf et commencez à couper une ouverture circulaire. Ce processus est connu sous le nom de fenêtrage. Assurez-vous que la coupe circulaire est suffisamment grande pour que l’embryon puisse être facilement accessible de n’importe quelle direction, car le positionnement de l’ovule peut devoir être ajusté en fonction de la position de l’embryon.

Maintenant, à l’aide d’un microscope chirurgical à zoom stéréo, localisez l’artère vitale droite ou RVA. Ici, la flèche indique le stade de développement de trois jours de l’embryon. Une fois le RVA localisé, avec l’utilisation d’une aiguille de 26 G, faites deux petits trous sur les côtés gauche et droit du RVA.

Ensuite, ajustez la sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler sur le RVA. La sonde d’imagerie du flux sanguin Doppler doit être placée à cinq plus moins un millimètre du site de l’ischémie et aux deux tiers de l’extrémité distale de l’ARV. Prenez la lecture de flux pendant 30 secondes à deux minutes, comme vous le souhaitez.

Cela fera la lecture de la phase de normoxie. Maintenant, moulez manuellement le bord de l’aiguille vertébrale pour donner au bord une forme de crochet à l’aide d’une pince nasale suivie d’une pince à dents. Maintenant, à l’aide d’un micro-manipulateur, insérez l’aiguille vertébrale juste sous l’artère vitale droite.

Vous êtes prêt à soulever l’aiguille de la colonne vertébrale. Maintenant, avec l’aide du micro manipulateur, soulevez lentement l’artère jusqu’à ce que le flux sanguin Doppler montre une diminution minimale de 80% du flux artériel. Une fois qu’une baisse de 80% ou plus du flux Doppler est obtenue, laissez l’aiguille vertébrale soulevée vers le haut, en tirant l’artère pendant cinq minutes.

Ce sera la période de l’ischémie. Après ce temps ischémique de cinq minutes, relâchez lentement l’artère à l’aide d’un micro manipulateur pour rétablir des niveaux de flux sanguin normaux. Maintenant, le débitmètre sanguin Doppler devrait afficher des lectures similaires à celles observées pendant la normoxie.

Ce sera la période de reperfusion dans la RVA. Après le processus I/R, appliquez deux, trois gouttes de PBS 1X sur l’embryon. Enfin, refermez la fenêtre avec Sellotape, puis replacez l’œuf dans l’incubateur à œufs pendant cinq heures et 55 minutes.

Après cinq heures et 55 minutes, sortez l’œuf de l’incubateur à œufs et placez-le sur le plateau à œufs et rouvrez la fenêtre. Exigences de traitement. Procédure. Pour le traitement des artères avec les médicaments, les activateurs ou les inhibiteurs, l’ARR doit être excisée après une heure de processus I/R.

Retirez l’embryon de la coquille en le sortant de la coquille sur une boîte de Petri stérile de 100 mm. Une fois l’embryon libéré dans la boîte de Pétri, excisez le RVA à l’aide de l’iris oculaire dans le guidage du microscope chirurgical à zoom stéréo. La dimension d’excision du RVA doit être jusqu’à 15 plus moins un millimètre distal du tronc et deux plus moins un millimètre vers le tronc.

Après avoir excisé le RVA, lavez-le avec 1X PBS dans une nouvelle boîte de Petri stérile. Pour les traitements souhaités, placez l’artère dans un tube centrifuge stérilisé de 1,5 millilitre rempli de 500 microlitres de solution de Ringer. Et après avoir placé l’artère dans le tube de centrifugeuse, mettez-la dans l’incubateur de laboratoire Centigrade à 37 degrés pendant cinq heures.

Après cinq heures d’incubation, retirez le RVA de l’incubateur de laboratoire de 37 degrés Centigrades et procédez aux traitements souhaités. Et maintenant, pour présenter les résultats. Pour vérifier l’utilité de notre modèle dans la recherche sur la reperfusion ischémique dans les artères ischémiques, nous avons d’abord examiné les activités des protéines régulatrices de l’oxygène 150 ou ORP150, de la superoxyde dismutase cytoplasmique un ou de la SOD1 et de la catalase.

Les IRA traités par I/R ont montré une activité accrue d’ORP150, de SOD1 cytoplasmique et de catalase par rapport au groupe témoin, cependant, la supplémentation en N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, un quencher ROS, a réduit le stress oxydatif dans le groupe I/R, comme cela peut être évident dans la figure actuelle. Pour établir l’utilité de ce modèle pour les investigations inflammatoires, nous avons examiné l’expression de I/R-1 bêta et TNF-alpha dans les ACV traités par I/R par rapport aux ACV témoins. Les deux interleukines se sont avérées surexprimées dans le groupe Hook-I / R par rapport au groupe témoin.

La supplémentation en naringénine, un médicament anti-inflammatoire, a considérablement réduit les niveaux d’IL1-bêta ainsi que de TNF-alpha. Ensuite, nous avons examiné l’expression de NLRP3 et NF-kappa bêta par transfert Western. Cette analyse a révélé des preuves d’activation de l’inflamasome NLRP3, ainsi que du NF-kappa bêta en réponse à l’I/R produit dans le RVA.

Semblable aux résultats précédents, Naringenin a réduit l’expression de NLRP3 et NF-kappa bêta. Ces résultats ont démontré que notre modèle pouvait être utilisé pour étudier les altérations inflammatoires. Ensuite, nous avons examiné l’effet de l’I/R sur les voies de l’apoptose et de l’autophagie.

Tout d’abord, dans la figure A, nous avons accédé à l’expression de la caspase-3 clivée. Nous avons observé une expression améliorée de la caspase-3 clivée dans le groupe I/R par rapport au groupe témoin, tandis que le groupe I/R recevant ZVADFMK a montré une diminution de l’expression de la caspase-3. De même pour l’autophagie, le groupe I /R présentait des niveaux élevés de protéines LC3, le marqueur d’autophagosome Beclin-1, un régulateur clé de l’autophagie dans les cellules de mammifères, et ATG-7, une protéine nécessaire à l’autophagie basale, que le groupe témoin, tandis que les groupes recevant 3-ma, un inhibiteur de l’autophagie, ont montré une diminution de l’expression des trois protéines d’autophagie ci-dessus, comme en témoignent les figures B à D.La figure E démontre l’effet de l’I/R médié par Hook sur les niveaux d’ARNm ambra-1 et ATG-7.

Ces résultats étaient conformes aux résultats précédents, c’est-à-dire qu’une expression accrue de l’ARNm a été observée pour l’ambra-1 et l’ATG-7 dans les AJR traités par I/R par rapport à leurs témoins respectifs. Cependant, les résultats ont été inversés lorsque 3-ma a été ajouté au groupe I / R. La figure actuelle représente l’efficacité de notre modèle pour étudier les altérations de l’ADN.

Nous avons observé un frottis d’ADN intense dans le groupe traité I/R par rapport au groupe témoin. Cependant, la supplémentation de NAC au groupe I/RVA a inversé le résultat. Pour examiner l’efficacité de notre modèle par rapport à d’autres modèles, nous avons comparé les données générées par notre modèle Hook-I/R et le modèle MCAO dans la présente expérience.

En bref, l’expression de la protéine apoptotique, la caspase-3 clivée, les protéines d’autophagie, Beclin-1 et ATG-7, et les interleukines inflammatoires, TNF et IFN, était forcément plus élevée dans les RVA traités par I/R que dans les ACV témoins. Fait intéressant, le modèle Hook-I/R a donné des résultats très similaires à ceux obtenus par le modèle MCAO, qu’il s’agisse de l’analyse du stress inflammatoire ou des voies de mort cellulaire. Notre modèle peut être utilisé pour des expériences de routine d’ischémie-reperfusion, seul ou parallèlement aux modèles existants.

Cependant, lors de l’imitation de l’ischémie-reperfusion, une précaution maximale doit être prise lors de la réalisation de trous, des côtés droit et gauche de l’ARV, ainsi que lors de l’obstruction ou de la libération de l’ARR afin qu’elle n’endommage pas les artères ou les veines. Dans la biologie moléculaire de routine telle que le Transfert western, l’analyseur QRT-PCR, les acides chimiques et les techniques d’imagerie pourraient être improvisés pour associer la physiopathologie associée à l’ischémie-reperfusion dans un embryon de poussin en développement de trois jours. Ce modèle pourrait être utilisé efficacement pour étudier la mécanique moléculaire au niveau de l’ADN, de l’ARN et des protéines.

Comme nous vous l’avons montré, la modélisation I/R dans un embryon de poussin en développement de trois jours, nous pensons que notre modèle ouvrira de nouvelles voies dans le domaine de la recherche I/R. Avec ce travail, je vous souhaite le meilleur pour vos expériences. Merci.