Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire
19 janvier 2022
L’analyse par microscopie vidéo à haute vitesse est un outil relativement facile à réaliser, rapide, rentable et, entre des mains expérimentées, un outil considérablement fiable pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire, qui devrait être disponible dans tous les centres impliqués dans le diagnostic et le traitement des maladies pulmonaires graves.
L’analyse par microscopie vidéo à grande vitesse est un outil fiable pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire. Cette technique est relativement facile à exécuter, rapide, rentable et entre des mains expérimentées, un outil très fiable. Et il est applicable pour les patients de tous les groupes d’âge.
La microscopie vidéo révèle également une fonction ciliaire secondaire. Comme, par exemple, en raison d’infections bactériennes ou virales. Mais il a été principalement utilisé pour diagnostiquer la dyskinésie ciliaire primaire.
Les scientifiques utilisent également cette méthode pour visualiser les processus intracellulaires ou les fonctions biologiques dans les cellules vivantes. Mme Tina Peromaa, notre technicienne de laboratoire, m’assistera dans cette procédure.
Avant de prélever les cellules épithéliales respiratoires, demandez au patient de bien se moucher. Lorsque le patient est prêt, gardez la tête du patient fixe d’une main et utilisez une brosse interdentaire de 0,6 millimètre de taille dans l’autre main pour brosser le cornet inférieur de la narine afin de recueillir suffisamment de bandelettes de cellules épithéliales. Déposer les bandes cellulaires récoltées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant le DMEM nourri par la cellule.
Après avoir fermé le couvercle du tube de microcentrifugation, maintenez le tube contre la source de lumière et secouez le tube pour découvrir les bandes et conglomérats cellulaires récoltés. Plus tard, placez les tubes de microcentrifugation avec les couvercles correctement fermés dans une boîte en polystyrène. Avant de fermer la boîte, assurez-vous que les tubes sont fixés à l’intérieur de la boîte.
Ajoutez ensuite un compresse froid à la boîte tout en évitant de congeler l’échantillon. Après avoir retiré les tubes de microcentrifugation contenant les échantillons de la boîte en polystyrène, placez un tube sous une hotte de l’unité de chauffage du microscope pour réchauffer jusqu’à 37 degrés Celsius pour l’analyse de microscopie vidéo à grande vitesse ou HSVMA. Ensuite, démarrez la caméra et le logiciel de l’unité vidéo sur l’ordinateur.
Utilisez une pipette pour prélever un petit échantillon et placez deux gouttes de l’échantillon dans une cuvette. Couvrir la cuvette avec un couvercle avant de la placer sous le microscope. Utilisez une lentille d’immersion dans l’huile avec un grossissement de 100x et placez une goutte d’huile d’immersion sur la surface de l’optique.
Tout en s’approchant du fond de la boîte avec la lentille du microscope, recherchez les amas de cellules sans globules rouges et avec une faible teneur en mucus. Après avoir trouvé une région d’intérêt représentative, ou ROI, concentrez-vous sur un groupe de cils battants avec les plus grands mouvements de cils et enregistrez une séquence vidéo. Enregistrez les cellules avec des cils battants du côté et d’en haut.
L’analyse représentative montre les mouvements normaux des cils vus de côté et d’en haut. L’échantillon d’un patient atteint de dyskinésie ciliaire primaire, ou PCD, avec une mutation du gène DNAH11 a démontré le schéma classique de battement ciliaire rigide et minimal. Vu de côté et au-dessus.
Chez un autre patient atteint de PCD présentant la même mutation, un schéma hypercinétique mais inefficace des cils battants a été observé. Un schéma pathologique de battement ciliaire et une fréquence de battement ciliaire ont également été observés chez un patient présentant des infections récurrentes des voies respiratoires supérieures. Si la procédure de brossage est effectuée rigoureusement, l’analyse HSVMA n’a pas pu être effectuée car les cellules épithéliales ciliées étaient recouvertes d’un revêtement de globules rouges.
L’étape la plus importante de la procédure est d’obtenir suffisamment de cellules respiratoires des brossages et de garder ce matériau bien conservé pour l’analyse vidéo. Le matériel restant peut être utilisé pour effectuer la microscopie électronique ou la microscopie immunoflourescense afin de détecter d’éventuels défauts structurels dans les cils ou de révéler des défauts et la synthèse de protéines ciliaires.
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Aperçu
L'analyse par microscopie vidéo à haute vitesse est un outil fiable et rentable pour le diagnostic de la dyskinésie ciliaire primitive. Elle est facile à réaliser et applicable à tous les groupes d'âge, ce qui la rend essentielle pour les centres traitant des maladies pulmonaires graves.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Médecine respiratoire
- Techniques de diagnostic
Contexte
- La dyskinésie ciliaire primitive est une affection qui affecte la fonction ciliaire.
- La microscopie vidéo à haute vitesse peut révéler à la fois la fonction ciliaire primaire et secondaire.
- Cette technique est particulièrement utile pour diagnostiquer les troubles respiratoires liés au dysfonctionnement ciliaire.
- Il est important que les cliniciens aient accès à des outils diagnostiques fiables.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'efficacité de la microscopie vidéo à grande vitesse dans le diagnostic de la dyskinésie ciliaire primitive.
- Évaluer l'applicabilité de cette technique chez des groupes de patients de différents âges.
- Mettre en évidence l'importance de cet outil diagnostique en milieu clinique.
Méthodes utilisées
- Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse.
- Évaluation du mouvement et de la fonction ciliaire.
- Comparaison des résultats selon diverses caractéristiques démographiques des patients.
- Évaluation de la fonction ciliaire secondaire en lien avec les infections.
Résultats principaux
- La microscopie vidéo à haute vitesse est efficace pour diagnostiquer la dyskinésie ciliaire primitive.
- La technique est fiable lorsqu'elle est réalisée par du personnel expérimenté.
- Elle permet d'obtenir des informations sur la fonction ciliaire secondaire.
- Applicable aux patients de tous âges, ce qui renforce son utilité en pratique clinique.
Conclusions
- La microscopie vidéo à grande vitesse devrait être un outil diagnostique standard en médecine respiratoire.
- Sa facilité d'utilisation et sa fiabilité la rendent adaptée au diagnostic de première intention.
- Une disponibilité généralisée peut améliorer les résultats chez les patients souffrant de maladies pulmonaires graves.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'analyse par microscopie vidéo à haute vitesse (HSVMA) offre une méthode rapide et rentable pour le diagnostic de première intention de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD), une maladie génétique rare affectant l'élimination muco-ciliaire. En permettant la visualisation directe des motifs de battement des cils dans les cellules épithéliales respiratoires vivantes, l'HSVMA favorise une détection précoce et réduit la dépendance à des techniques plus exigeantes en ressources, telles que la microscopie électronique en transmission. Cette capacité améliore le débit diagnostique dans les centres de pneumologie et de maladies rares, facilitant une intervention rapide et réduisant les complications pulmonaires à long terme.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation fonctionnelle de la mobilité ciliaire dans des cellules dérivées de patients, soutenant ainsi la validation de cibles en recherche sur les ciliopathies.
- Valeur opérationnelle : Offre un indicateur reproductible pour évaluer les interventions génétiques ou pharmacologiques sur la fonction ciliaire.
- Valeur prédictive : Permet de distinguer les défauts structurels des défauts fonctionnels, renforçant la confiance dans les hypothèses mécanistiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives sur la fréquence et la forme d'onde des battements ciliaires pour la normalisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Facilite l'élaboration de protocoles normalisés pour l'imagerie de cellules vivantes dans les modèles de maladies respiratoires.
- Extensibilité : Permet une analyse à haut contenu des dynamiques ciliaires sur plusieurs échantillons de patients ou variants génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro aux phénotypes cliniques en corrélant les sorties de la HSVMA avec la gravité de la maladie.
- Dérisquage mécanistique : Identifie un effet de sauvetage fonctionnel dans les modèles précliniques par la restauration du battement ciliaire normal.
- Alignement des biomarqueurs : Fournit des lectures fonctionnelles qui complètent les biomarqueurs structuraux ou moléculaires dans la DCP.
Intégration du pipeline et du flux de travail
HSVMA s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible à l'évaluation préclinique, en offrant un test fonctionnel pour le développement de thérapeutiques ciliées.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les gènes impliqués dans l'assemblage et la motilité des cils, tels que DNAH11.
- Écrantage : Fournit des mesures quantitatives en temps réel adaptées à l'écrantage de composés dans des modèles de ciliopathies.
- Analyse : Permet la comparaison statistique des paramètres du battement ciliaire entre différentes conditions, soutenant ainsi la prise de décisions fondées sur les données.
- Recherche translationnelle : Relie les phénotypes cellulaires aux résultats cliniques, facilitant la transition de la phase préclinique à la phase clinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour évaluer la fonction ciliaire dans divers modèles de maladies respiratoires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant une visualisation directe de la dynamique ciliaire dans des contextes cellulaires natifs.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles définis d'échantillonnage, de préservation et d'imagerie.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt dans la validation des cibles en confirmant la pertinence fonctionnelle des résultats génétiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles de ciliopathies fondée sur des preuves de récupération fonctionnelle.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la collecte de cellules, la manipulation du microscope et l'analyse vidéo pour une interprétation précise.
- Dépend de systèmes de microscopie vidéo à grande vitesse équipés d'optiques à immersion à l'huile et d'un contrôle environnemental.
- Exige des procédures normalisées de manipulation des échantillons afin d'éviter toute contamination ou dégradation.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des conditions de culture et des paramètres d'imagerie.
- Limitée par la nécessité d'échantillons épithéliaux viables et non contaminés ; la présence de globules rouges ou de mucus peut entraver l'analyse.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
