Induction de l’inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T CD4⁺ transgéniques CBir1 TCR à des souris immunodéficientes

Les maladies inflammatoires de l’intestin, ou MII, imposent un fardeau sanitaire et financier considérable aux individus et à la société. Ce modèle de colite est utile pour étudier les mécanismes des MII et évaluer les traitements des MII. Ce modèle de colite adoptive de transfert spécifique aux lymphocytes T de la flagelline Cbir immunodominant fournit des informations sur la façon dont l’antigène des bactéries intestinales induit des réponses des lymphocytes T pour induire la colite.

Après avoir euthanasié la souris, faites une incision abdominale gauche d’environ un centimètre et éloignez la peau du tissu musculaire abdominal. Ensuite, faites une incision d’environ trois centimètres dans le tissu musculaire abdominal. Ensuite, retirez la rate avec des ciseaux et des pinces stériles.

Placer la rate dans un plat de culture contenant cinq millilitres de tampon de lavage pré-refroidi. Broyer la rate avec la surface rugueuse de deux lames de verre stériles. Transférez la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres en la faisant passer à travers une crépine de cellule de 100 micromètres.

Rincez les lames de verre et le plat de culture avec cinq millilitres de tampon de lavage pré-refroidi et transférez le tampon de lavage dans le tube. Centrifuger la suspension cellulaire, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec cinq millilitres de tampon de lyse de chlorure d’ammonium Tris préavertis par rate. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Ajouter 10 millilitres de tampon de lavage pré-refroidi au tube. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec 10 millilitres de tampon d’isolement pré-refroidi. Pour compter les cellules, mélangez soigneusement 10 microlitres de suspension cellulaire et de bleu Trypan et chargez 10 microlitres sur une lame.

Ensuite, insérez la diapositive dans le compteur de cellules automatisé pour obtenir le numéro de cellule viable. Centrifuger la suspension de cellule restante et jeter tout surnageant. Vortex les particules magnétiques CD4 anti-souris, ajouter directement 50 microlitres de particules par 10 millions de cellules, et mélanger avec des pastilles de cellules à fond.

Incuber le mélange pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer la suspension de particules cellulaires dans un tube de collecte stérile. Ajouter 3,5 millilitres de tampon d’isolation pré-refroidi dans le tube.

Placez le tube sur l’aimant de séparation cellulaire pendant huit minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant avec une pipette de transfert de trois millilitres. Retirez le tube de l’aimant de séparation des cellules.

Ensuite, remettez en suspension les cellules avec 3,5 millilitres de tampon d’isolation pré-refroidi et placez le tube sur l’aimant pendant quatre minutes à température ambiante. Aspirer soigneusement le surnageant avec une pipette de trois millilitres. Enfin, remettez en suspension les cellules dans un millilitre de tampon FACS pré-refroidi.

Pour transférer les cellules chez les souris receveuses, remettez en suspension les lymphocytes T4 positifs transgéniques Cbir1 TCR à 5 millions de cellules par millilitre dans 1x PBS. Réchauffez les souris sous une lampe chauffante et retenez les souris à l’aide d’un dispositif de retenue pour souris. Injecter par voie intraveineuse 200 microlitres de la suspension cellulaire dans la veine caudale des souris.

Après avoir euthanasié la souris, faites une incision cutanée médiane ventrale d’environ un centimètre. Éloignez la peau du tissu musculaire abdominal. Ensuite, faites une incision de trois centimètres dans le tissu musculaire abdominal.

Ensuite, identifiez le coecum et retirez tout le côlon avec des ciseaux et des pinces stériles. Mouiller le côlon avec du PBS pré-refroidi dans un plat de culture. Inciser le côlon dans le sens de la longueur et le rincer avec du PBS pré-refroidi.

Couper 1/3 du côlon longitudinalement. Placez la bande du côlon dans une serviette en papier avec le côté lumineux tourné vers le haut. Effectuez un laminage suisse à l’aide d’un cure-dent.

Placez le côlon Suisse dans une cassette et mettez la cassette dans du formol tamponné à 10% pendant 24 heures. Déshydratez et incorporez le côlon à la paraffine avec un processeur automatisé. Ensuite, coupez des sections de tissu de cinq micromètres sur un microtome.

Montez le tissu sur des lames et effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Les souris Knock-out Rag ont commencé à perdre du poids environ trois semaines après le transfert cellulaire, et leur poids a atteint environ 80 à 85% de leur poids initial six semaines après le transfert cellulaire. Les souris receveuses ont montré une courte durée du côlon six semaines après le transfert cellulaire.

Les souris receveuses ont démontré plus d’infiltration cellulaire dans la lamina propria intestinale quatre semaines après le transfert cellulaire. Ils ont montré une perte de cellules gobelet et une hyperplasie des cellules épithéliales intestinales cinq semaines après le transfert cellulaire, ainsi qu’une érosion muqueuse et une infiltration cellulaire inflammatoire dans la sous-muqueuse du côlon six semaines après le transfert cellulaire. Les scores histopathologiques ont considérablement augmenté de quatre à six semaines.

Simultanément, il n’y avait pas d’inflammation chez les souris Knock-out Rag recevant PBS seul. En utilisant cette procédure, les niveaux de cytokines du côlon ont pu être déterminés par ELISA et qPCR.