Culture de lymphocytes en microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotatif

Cette technique nous permet d’étudier les effets de la microgravité simulée sur les cellules immunitaires pour nous aider à mieux comprendre comment les aspects de l’environnement spatial affectent la physiologie humaine au niveau moléculaire. Cette technique est économiquement réalisable et est relativement facile à mettre en place et à entretenir par rapport à l’envoi de cultures cellulaires dans l’espace ou à d’autres méthodes de soumission de la culture cellulaire à la microgravité simulée sur Terre. Il est recommandé d’aller lentement pendant le remplissage des récipients afin d’éviter les débordements et les déversements.

Après le retrait initial des bulles, assurez-vous que les vaisseaux sont complètement pleins à l’aide des seringues. Cela minimisera les risques de formation de grosses bulles tout au long du traitement. Commencez par retirer les récipients de culture de l’emballage en plastique.

Étiquetez chaque récipient sur le bord en fonction du type de cellule ou de la lignée utilisée, qu’il s’agisse du témoin ou du traitement, et de toute autre information pertinente. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage ou le joint torique. Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol avec la cheville ou le joint torique vers le haut pendant que le récipient est rempli.

Ne retirez pas les capuchons des orifices de la seringue. Charger le récipient avec 10 mL du milieu complet approprié pour la culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique stérile et placer soigneusement le bouchon sur l’orifice de remplissage. Assurez-vous que les bouchons de l’orifice de la seringue et l’orifice de remplissage sont bien fermés.

Ensuite, placez les récipients remplis dans un incubateur tout en effectuant les étapes suivantes pour amorcer les vaisseaux pour la culture cellulaire. Récupérez les récipients amorcés du média de l’incubateur. Pour un témoin en fiole, charger une fiole de culture en suspension T25 avec 10 mL de culture cellulaire provenant du stock préparé ci-dessus.

Ajouter 10 mL de culture cellulaire mère dans un tube conique séparé de 15 mL, qui sera utilisé pour charger les seringues. Dévissez les bouchons d’orifice de la seringue pour les retirer du navire et vous assurer que les robinets d’arrêt d’origine sont en position ouverte. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage ou le joint torique.

Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol avec la cheville ou le joint torique vers le haut pendant que le récipient est rempli. Assurez-vous que les robinets d’arrêt sont en position ouverte. Le récipient peut être vidé en versant le fluide du récipient dans un conteneur à déchets à l’aide d’une pipette sérologique.

Vous pouvez également aspirer le média à l’aide d’un verre stérile au-delà de votre pipette fixée à un système de vide. Lorsque vous utilisez une pipette ou le système de vide, assurez-vous de ne pas toucher la membrane d’oxygénation, car cela pourrait l’endommager et rendre le récipient inutilisable. Fermez hermétiquement le tube conique de 50 ml contenant la culture cellulaire mère préparée et retournez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.

Prélever 10 mL de stock de culture cellulaire à partir du tube de 50 ml avec une pipette sérologique fraîchement stérile. Ramassez le récipient et inclinez-le, de sorte que l’orifice de remplissage soit vers le haut. Ensuite, distribuez soigneusement le stock de culture cellulaire dans le récipient par l’orifice de remplissage.

Remplissez le récipient jusqu’à l’extrémité de l’orifice de remplissage, tout en inclinant le récipient vers le bas pour éviter les déversements. Attention à ne pas toucher la membrane d’oxygénation avec la pipette car elle est très fragile. Une fois le navire chargé, remettez soigneusement le bouchon de l’orifice de remplissage sans toucher le joint torique.

Retirez la première seringue de 3 ml de son emballage et pompez-la plusieurs fois pour la desserrer. Ensuite, fixez la seringue à l’un des orifices de la seringue, en vous assurant que la seringue est complètement enfoncée. Fermez hermétiquement le tube conique de 15 mL contenant 10 mL de culture cellulaire aliquote et retournez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.

De même, retirez la deuxième seringue de 3 mL de son emballage et pompez-la plusieurs fois. Ensuite, semi immergé soigneusement cette seringue dans la culture cellulaire à partir du tube conique de 15 ml et prélever une culture. Minimisez les bulles d’air en redistribuant entièrement la seringue dans le tube et en aspirant 3 ml de culture.

Fixez la seringue remplie au port de seringue restant et désinfectez soigneusement les seringues et autour de l’orifice de remplissage avec un tampon d’éthanol. Ne pas mettre d’éthanol sur la membrane d’oxygénation. Répétez le processus pour les navires restants.

S’il reste une culture cellulaire légèrement insuffisante dans le tube conique de 50 ml pour le dernier vaisseau, récupérez la quantité restante du tube conique de 15 ml utilisé pour charger les seringues. Assurez-vous que les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue sont fermés pour limiter la migration des cellules et des bulles des seringues dans les vaisseaux. Retournez le récipient à l’envers et frappez-le plusieurs fois sur le côté pour recueillir les bulles initiales.

Retournez rapidement le navire vers l’arrière, puis sur un léger angle vers l’extérieur, de sorte que les bulles flottent toutes vers le haut du navire. Manœuvrez les bulles sous le port avec la seringue vide et regardez-les commencer à entrer dans le port. Ouvrez les deux robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue.

Frappez doucement le récipient pour encourager les bulles à flotter dans la seringue vide. Aspirez lentement les grosses bulles avec la seringue vide tout en appuyant soigneusement sur la seringue pleine pour maintenir la pression dans le récipient, de sorte que la membrane d’oxygénation n’éclate pas. Répétez ce processus plusieurs fois pour vous assurer que toutes les bulles sont éliminées.

Lorsque les bulles ont été efficacement éliminées, fermez les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue. Gardez les seringues pendant le traitement pour permettre l’élimination ultérieure des bulles, en veillant à ce que le volume dans les deux seringues soit approximativement égal. Essuyez soigneusement la surface de la base rotative et du câble ruban avec de l’éthanol à 70%.

Assurez-vous que le câble ruban est connecté au bloc d’alimentation. Placez la base rotative dans l’incubateur et fixez le câble ruban à la base. Placez le bloc d’alimentation à proximité, mais à l’extérieur de l’incubateur.

Fixez la cuve de traitement SMG en alignant les filetages de la cuve à la cheville rotative et en tournant doucement la cheville rotative sur la base dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que le navire est bien attaché. Maintenez l’incubateur à environ 100% d’humidité en remplissant le bac à eau avec de l’eau autoclave RO.

Ajustez la vitesse de rotation de l’incubateur pour qu’elle corresponde à la vitesse de sédimentation des cellules, de sorte que les cellules ne tombent pas à travers le milieu. Le premier jour de la mise en place du traitement, vérifiez la formation de bulles toutes les quelques heures, comme décrit dans le manuscrit du texte. Retirez les bulles au moins une fois par jour jusqu’à la fin de la durée de traitement souhaitée.

Une fois la durée de traitement prévue écoulée, arrêtez la rotation et démontez l’appareil. Retirez le récipient de traitement en maintenant doucement le récipient immobile tout en tournant la cheville rotative de l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre. Amener la fiole de contrôle, la force de contrôle et le récipient traité dans une enceinte de sécurité biologique stérile.

Prenez chaque récipient à l’exception de la fiole de commande et retournez-le de manière à ce qu’il soit orienté vers le bas. Puis frappez-le doucement pour mettre toutes les cellules en suspension. Ensuite, tournez le récipient sur le côté avec l’orifice de remplissage vers le bas et frappez-le à nouveau pour guider les cellules vers l’orifice de remplissage pour une aspiration efficace.

Manipulez chaque navire individuellement. Dévissez les seringues des deux orifices et distribuez-les dans les déchets présentant un risque biologique. Ouvrez les robinets d’arrêt des orifices de seringue.

Retirez délicatement le bouchon de l’orifice de remplissage et aspirez le contenu à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL, en inclinant le récipient lorsqu’il est vidé. Distribuer le contenu de tous les groupes témoins et de traitement dans des tubes coniques de 15 mL étiquetés individuellement. Fermez chaque tube et retournez-les doucement plusieurs fois pour vous assurer qu’ils sont bien mélangés.

Utiliser la méthode préférée pour déterminer la concentration et la viabilité de la culture cellulaire résultante afin de se préparer aux essais expérimentaux ultérieurs. La viabilité initiale et les densités de sièges de la lignée cellulaire NK-92 ont été comparées à la viabilité finale et aux concentrations terminales résultantes. Après un traitement SMG de 72 heures, deux cas de résultats négatifs et positifs ont été comparés.

À titre de comparaison, la plage de concentration optimale de la lignée cellulaire NK-92 utilisée était comprise entre 0,3 et 1,2 million de cellules par millilitre avec un temps de doublement d’environ deux à trois jours. La prolifération dans le groupe de traitement SMG était approximativement égale dans les groupes témoins et de traitement. Ces paramètres étaient essentiels pour le succès expérimental en aval et les cellules résultantes des deux groupes témoins ont donné des résultats similaires dans les essais expérimentaux en aval.

Il est crucial de surveiller et de tenir compte de la formation de bulles tout au long du traitement, en particulier dans la culture cellulaire soumise à une microgravité simulée. La formation de grosses bulles peut perturber la dynamique des fluides à l’intérieur du récipient, ce qui annulera essentiellement la condition de microgravité simulée.