Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

Ce protocole optimisé a amélioré la génération de précurseurs de cellules bêta pancréatiques à partir de cellules souches pluripotentes humaines, qui peuvent être utilisées pour la thérapie cellulaire du diabète et l’étude des mécanismes moléculaires sous-tendant la biogenèse du diabète. C’est une technique réalisable car elle est utilisée pour les cultures monocouches 2D. Il est facile à appliquer et est cohérent entre plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes de contrôle et dérivées de patients.

Ces précurseurs de cellules bêta, lorsqu’ils sont transplantés chez un patient diabétique, peuvent mûrir en cellules bêta sécrétant de l’insuline et peuvent potentiellement inverser l’hyperglycémie. Par conséquent, les pourcentages accrus de progéniteurs pancréatiques générés à l’aide de notre protocole peuvent être utilisés pour la thérapie cellulaire pour le diabète. Ce protocole amélioré peut être utilisé pour étudier le développement pancréatique humain précoce chez les individus en bonne santé ainsi que chez les patients diabétiques, ce qui est difficile en raison d’une pénurie d’échantillons de tissus.

Lorsque les colonies de cellules souches pluripotentes humaines ou de CSPh ont atteint 70 à 80% de confluence, lavez-les deux fois avec du PBS chaud à l’intérieur du capot de culture tissulaire. Ensuite, aspirez le tampon à l’aide d’un aspirateur à vide portable. Ensuite, ajoutez le milieu de différenciation de la première étape contenant CHIR-99021 aux colonies et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, remplacez le milieu usé par un milieu de différenciation de la première étape sans CHIR-99021. Après avoir aspiré le milieu usé et lavé deux fois les cellules endodermiques définitives avec du PBS chaud, agitez la plaque pour éliminer tous les débris cellulaires. Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde et placez la plaque sur un agitateur bidimensionnel.

Après la fixation, laver les cellules avec une solution saline tamponnée TRIS contenant 0,5% de Tween et placer la plaque sur le shaker. Ensuite, perméabilisez les cellules fixes en ajoutant une quantité généreuse de PBS contenant 0,5% de Triton X-100 et replacez la plaque sur le shaker. Ensuite, ajoutez un tampon de blocage fraîchement préparé aux cellules perméabilisées et incuber la plaque pendant une heure sur le shaker.

Ensuite, ajoutez des anticorps primaires dilués aux cellules bloquées et placez la plaque sur l’agitateur à quatre degrés Celsius en agitant doucement. Le lendemain, après avoir aspiré la solution d’anticorps primaires, laver les puits trois fois avec TBST pendant 10 minutes chacun sur le shaker. Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires.

Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière et placez la plaque sur le shaker à température ambiante pendant une heure. Ensuite, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les puits colorés avec du TBST sur l’agitateur pendant 10 minutes, en gardant la plaque recouverte de papier d’aluminium. Ensuite, pour colorer les noyaux, ajoutez la solution Hoechst aux puits et placez la plaque sur le shaker.

Après deux à trois minutes, aspirez la solution Hoechst et rincez les puits deux fois avec du PBS. Enfin, ajoutez du PBS aux cellules colorées et imagez-les à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée dans l’obscurité. Le premier jour de la deuxième étape, dissocier les cellules endodermiques dérivées de l’hPSC en les lavant d’abord avec du PBS chaud, puis en ajoutant un millilitre de solution enzymatique chaude par puits d’une plaque de six puits.

Placez la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois à cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher les unes des autres. Dissocier les feuilles détachées ou la monocouche de cellules dans les puits et recueillir les cellules détachées ensemble dans un tube en polypropylène de 15 millilitres à l’aide d’un demi-média de l’étage basal. Ensuite, faites tourner les cellules vers le bas, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension à l’aide d’un millilitre de PBS stérile.

Après avoir compté les cellules à l’aide d’un compteur automatisé, faites tourner les cellules à nouveau et jetez le surnageant. Remettez ensuite la pastille en suspension dans le volume approprié du milieu de différenciation de stade deux contenant un inhibiteur de roche. Plaquez les cellules remises en suspension sur une à 50 plaques revêtues de matrice membranaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, remplacez le média par un milieu de différenciation de stade deux sans l’inhibiteur de roche. À la fin de la quatrième étape, détachez les cellules comme démontré précédemment et recueillez-les dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules, jetez le surnageant, lavez les cellules avec du PBS et dissociez-les en cellules individuelles.

Après avoir compté les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, faites tourner les cellules à nouveau et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS réfrigéré. Ensuite, ajoutez deux millilitres d’éthanol refroidi à 80% avec le tube sur un vortex réglé à basse à moyenne vitesse. Fermez bien le capuchon et placez le tube légèrement incliné sur le shaker à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, faites tourner les cellules et lavez la pastille avec du PBS pour dissocier les amas de cellules fixes. Ensuite, bloquez les cellules fixes pendant au moins une heure à température ambiante ou quatre degrés Celsius pendant la nuit sur le shaker. Ensuite, pour colorer les marqueurs progéniteurs pancréatiques, répartir 200 000 cellules par affection, y compris les témoins d’isotypes appropriés, les témoins non colorés et les témoins d’anticorps secondaires dans une plaque inférieure de 96 puits V.

Ensuite, faites tourner brièvement la plaque et retournez la plaque avec un mouvement rapide pour jeter le surnageant sans perdre les granulés. Ensuite, incuber les cellules dans les anticorps primaires pendant au moins deux heures à température ambiante sur un agitateur avec agitation douce. Ensuite, lavez les cellules colorées trois fois avec TBST en tuyautant de haut en bas dans les puits.

Centrifuger à nouveau les cellules, jeter le surnageant et ajouter des anticorps secondaires aux cellules. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, laver les cellules colorées deux fois avec TBST. Ensuite, faites tourner la plaque, recueillez les cellules colorées dans 100 microlitres de PBS dans des tubes de fax protégés contre la lumière et exécutez les échantillons sur une machine de cytométrie en flux.

Par rapport à la méthode non optimisée, le protocole optimisé a amélioré l’efficacité de la différenciation des progéniteurs pancréatiques en régulant à la hausse la co-expression PDX 1 et NKX 6.1. En particulier, la dissociation des cellules endodermiques et leur replacage sur une matrice membranaire fraîche, ainsi qu’une durée plus longue de la troisième étape, ont amélioré l’expression de NKX 6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de hPSC par rapport au protocole non dissocié. Les progéniteurs pancréatiques générés à l’aide du protocole optimisé ont également augmenté le nombre de cellules SOX9 positives par rapport à la méthode non dissociée.

De plus, la méthode optimisée a également généré une proportion plus élevée de cellules positives NKX 6.1 prolifératives qui ont co-exprimé le marqueur de prolifération Ki67. Afin d’améliorer l’efficacité, il est crucial de dissocier l’endoderme dérivé de l’HbA1, puis de prolonger la durée du traitement de troisième étape avec la signalisation amyloïde FGF et l’inhibition de Hedgehog. La génération évolutive de progéniteurs pancréatiques à l’aide de ce protocole amélioré a facilité les études sur l’amélioration de l’efficacité et de la maturation des cellules bêta pancréatiques dérivées de cellules souches pluripotentes humaines et a permis la modélisation de différents types de diabète.