Isolement et profilage des cellules endothéliales artérielles mésentériques primaires humaines au niveau du transcriptome

La caractérisation de l’expression des gènes au niveau transcriptomique est essentielle pour comprendre la fonction cellulaire dans la santé et la maladie. Notre méthode se concentre sur la capture des cellules endothéliales, la couche cruciale de la paroi vasculaire, des artères ménestériques des donneurs humains pour le profilage transcriptomique avec une résolution unicellulaire et spatiale. Il existe une population enrichie de cellules endothéliales provenant d’un vaisseau sans étape de tri, ce qui peut entraîner une perte cellulaire.

En outre, il existe d’autres types de cellules qui permettent d’étudier les interactions cellule-cellule dans le contexte tissulaire. Nous avons utilisé cette technique pour étudier les changements artériels dans le diabète et l’obésité. Selon la disponibilité du vaisseau, ces techniques peuvent également être réutilisées pour explorer la biologie dans d’autres maladies vasculaires et autres.

Si c’est la première fois, deux étapes clés nécessitent le plus de pratique. Premièrement, le grattage, bien qu’une force adéquate, doit être exercée pour éliminer les cellules intégrales sans détacher les couches plus profondes. Et deux, le sectionnement du cryostat.

Assurez-vous que les sections sont froides, plates et dans les limites de la glissière spécialisée. Yingjun Luo et Xiaofang Tang, deux chercheurs post-doctoraux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, lavez le mouchoir en papier avec du DPBS.

Avec une pince stérile et des ciseaux à dissection, retirez la graisse et les tissus conjonctifs externes jusqu’à ce que le vaisseau soit propre. Mesurez la longueur du récipient avec une règle placée à l’extérieur du plat et prenez des enregistrements photographiques. Coupez l’artère mésentérique dans le sens de la longueur avec des ciseaux pour ouvrir la lumière du vaisseau verticalement.

À l’aide d’aiguilles, fixez le récipient sur de la cire noire aux quatre coins, exposant l’intima. Ajouter un millilitre de tampon de digestion préchauffé à intima. À l’aide d’un scalpel stérile, grattez doucement la lumière du vaisseau deux fois.

Transférer le tampon de digestion dans un tube. Ajouter un millilitre de tampon de digestion à l’intima et pipeter soigneusement de haut en bas pour recueillir les cellules restantes et transférer la suspension cellulaire dans un tube. Incuber des cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un incubateur ou sur une bascule.

Ajouter le milieu M199 à la suspension cellulaire pour éteindre la réaction enzymatique et mélanger doucement. Centrifuger la suspension pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 600 fois G.At la fin de la centrifugation, retirer et stocker le surnageant séparément comme culture témoin pour observer si toutes les cellules sont capturées dans la pastille. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de milieu M199.

Évaluez la viabilité cellulaire en mélangeant 10 microlitres de bleu de trypan avec 10 microlitres de stock cellulaire. Observez la morphologie cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Enduire deux puits d’une plaque de six puits en pipetant 500 microlitres de réactif de fixation dans des puits pendant 30 minutes à température ambiante.

Après avoir lavé les puits avec du DPBS stérile, distribuez le stock cellulaire complet dans un puits, et le surnageant est conservé comme contrôle dans le deuxième puits. Centrifugeuse préalablement préparée à quatre degrés Celsius et 600 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille doucement avec une pipette P-1000 dans 0,04% BSA dans DPBS.

Bien mélanger pour assurer une suspension à cellule unique. Passez la solution à travers une passoire de 40 micromètres pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, centrifugez la suspension et retirez le surnageant comme démontré.

Remettez la pastille dans 500 microlitres de 0,04 % BSA dans le DPBS à l’aide d’une pipette P-1000 et mélangez bien pour assurer une suspension à cellule unique. Comme démontré précédemment, évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du bleu de trypan. À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, observez la morphologie de la suspension unicellulaire, vérifiez la présence de débris tissulaires et calculez le nombre de cellules vivantes et mortes.

Après avoir ajouté de l’isopentane à une cartouche métallique, refroidir dans de l’azote liquide ou de la glace carbonique. Versez le composé OCT dans des puits de moule cryogénique en plastique étiqueté, empêchant la formation de bulles. Laissez la moisissure cryogénique sur de la glace carbonique pour refroidir.

Coupez au moins deux sections coronales d’un centimètre dans la longueur du vaisseau. À l’aide d’une pince de 12 pouces, immergez le tissu dans l’isopentane jusqu’à ce qu’il soit congelé. Immergez rapidement le tissu dans l’OCT à l’orientation avec la lumière visible au centre.

Saisissez et placez les moules cryogéniques sur de la glace carbonique et observez la congélation. L’OCT deviendra blanc progressivement de l’extérieur en une à deux minutes. Conservez ces sections dans un contenant sécurisé à moins 80 degrés Celsius pendant six mois.

Réglez la température de cryostat souhaitée pour la chambre et la tête de l’échantillon. Équilibrez les sections de récipients, les couteaux, les brosses et les glissières incorporés dans l’OCT jusqu’à moins 20 degrés Celsius dans le cryostat pendant environ 30 minutes. Lors de l’équilibrage, nettoyez la machine et tous les équipements susceptibles de toucher les sections, y compris la lame, avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution de décontamination À la RNase.

Fixez l’échantillon en distribuant une petite quantité d’OCT sur le bloc de cryostat circulaire et en plaçant l’échantillon sur le dessus avant qu’il ne gèle. Après avoir placé le bloc au centre de la tête de l’échantillon, vissez le bloc en place à l’aide de la grande poignée noire sur la gauche. Éliminez tout excès d’OCT entourant le navire.

Réglez l’épaisseur de coupe à 10 micromètres sur le cryostat, coupez environ 60 sections et placez-les dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre contenant un réactif d’extraction d’ARN. Vortex jusqu’à ce que les sections soient complètement dissoutes. Extraire l’ARN tel que décrit dans le manuscrit du texte et dissoudre la pastille d’ARN purifiée dans cinq microlitres d’eau sans RNase.

Coupez des sections de 10 micromètres d’épaisseur avec une plaque anti-roulis en place. Retournez et aplatissez soigneusement en touchant doucement la section à travers l’OCT environnant. Essuyez la glissière avec de l’éthanol et préchauffez l’arrière de la zone de capture avec votre doigt.

À l’aide de brosses cryostatiques sans RNase ou directement de la lame, placez la section de tissu dans le carré en utilisant uniquement l’OCT environnant. Placez immédiatement un doigt à l’arrière de la zone de capture pour faire fondre la section sur la lame. Une fois que la section adhère, placez la glissière sur la barre cryogénique pour permettre à la section de geler.

Coupez des coupes de tissu de 10 micromètres d’épaisseur comme démontré précédemment sur des lames d’optimisation tissulaire ou d’expression génique. Transférez la diapositive dans un publipostage placé sur de la glace carbonique. La figure représente des CE isolés cultivés à l’aide du protocole décrit présentant une morphologie pavée distincte avec un minimum de cellules contaminantes.

L’expression de la cadhérine endothéliale vasculaire marqueur EC a été confirmée à l’aide d’une immunofluorescence visualisant les jonctions de cellule à cellule. Environ 80 % des cellules étaient CD31 positives, ce qui indique que les EC artériels mésentériques humains constituaient la majeure partie de la population cellulaire fraîchement isolée. Les isolements infructueux entraînent des cellules dont la morphologie est perturbée, exprimant potentiellement des marqueurs mésenchymateux ou s’allongeant ressemblant à un état fibroblastique.

La figure montre une approximation et une projection de variété uniformes représentatives isolées pour l’artère mésentérique en utilisant le protocole actuel pour le séquençage de l’ARN unicellulaire sur le SEC artériel mésentérique humain isolé, avec 34% de cellules regroupées en ce qui concerne les CE utilisant PECAM1 et VWF comme marqueurs. L’ARN de haute qualité doit présenter un nombre d’intégrité de l’ARN pas inférieur à six, et le rapport des bandes d’ARN ribosomiques 28S à 18S est aussi proche de deux que possible. Une faiblesse ou une absence de ces signaux d’ARN ribosomique peut être observée lorsque les ARN sont dégradés.

La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a visualisé la morphologie du vaisseau, ce qui a permis d’identifier les régions d’intérêt. L’expression des gènes a été visualisée avec un ancrage spatial sur le vaisseau coloré à l’hématoxyline et à l’éosine. Manipulez soigneusement les tissus et les cellules pour maintenir la qualité de l’ARN, en particulier pour le profilage du transcriptome spatial.

Assurez-vous que le tissu est placé sur de la glace carbonique pour réduire la dégradation de l’ARN. Manipulez également les sections et les tissus avec des instruments pré-refroidis. Nous avons été en mesure d’explorer les changements de l’expression des gènes EC, y compris les ARNnc dans le contexte du diabète et de leur interaction avec d’autres types de cellules.

Nous pouvons déduire l’emplacement de ces changements transcriptomiques à l’aide de techniques de profilage du transcriptome spatial.