Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

L’estimation d’un taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. Le principal avantage de la technique de chargement présentée est que la coloration n’a été effectuée que pour les cellules d’intérêt.

Notre méthode d’enregistrement de l’intransigeance calcique offre une très bonne résolution spatio-temporelle. La méthode d’enregistrement présentée peut être utile aux neurophysiologistes qui ont besoin d’enregistrer des processus périodiques rapides à l’aide d’un microscope confocal. L’étape la plus difficile de la technique de chargement consiste à maintenir le nerf à l’intérieur de la pipette.

Le diamètre de la pipette doit être parfaitement ajusté, alors faites-en plusieurs. Savoir que toutes les étapes du protocole sont compliquées et démontrer chacune d’entre elles aidera beaucoup. Commencez par fixer le tissu musculaire releveur auris longus de manière légèrement étirée dans la boîte de Petri recouverte d’élastomère avec les fines broches en acier inoxydable et ajoutez la solution de Ringer à la boîte jusqu’à ce que le muscle soit complètement couvert.

Ensuite, utilisez un extracteur de micropipette pour préparer une micropipette avec une pointe fine et tranchante pour les enregistrements intracellulaires. Utilisez des capillaires sans filaments internes. Après avoir entaillé la conicité avec un abrasif, cassez l’embout de la micropipette en laissant une pointe ouverte à environ 100 micromètres de diamètre.

Ensuite, polissez la pointe jusqu’à ce que le diamètre intérieur passe de 80 micromètres à 12 micromètres. Lorsque vous avez terminé, fixez un tube en silicone d’un côté et une seringue sans aiguille de l’autre côté de la pipette de remplissage. Sous un stéréomicroscope, trouvez où le tronc nerveux se transforme en branches nerveuses séparées.

Placez la pipette de remplissage sur la boîte de Petri à l’aide de cire, puis déplacez l’embout de la pipette jusqu’à ce qu’elle se trouve au-dessus du nerf. Coupez le nerf près de la fibre musculaire avec de fins ciseaux, en laissant un petit morceau du moignon nerveux, d’environ un millimètre de long. Ensuite, aspirez le moignon nerveux avec une solution de Ringer dans l’extrémité de la pipette de remplissage, sans pincer le nerf.

Une fois cela fait, retirez le tube en silicone de la pipette de remplissage. Plus tard, utilisez une seringue avec un long filament pour aspirer la solution de chargement du colorant. Ensuite, insérez l’embout du filament avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage et relâchez le mélange sur le moignon nerveux, puis incuber la préparation nerveuse à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.

Après l’incubation, rincer la préparation nerveuse avec la solution fraîche de Ringer avant de la traiter avec 50 millilitres de solution de Ringer dans un bécher en verre à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Pour la microscopie confocale, montez la préparation nerveuse dans une chambre expérimentale recouverte d’élastomère de silicium et fixez-la, légèrement étirée, avec un ensemble de microaiguilles en acier. Ensuite, rincez abondamment la préparation avec la solution de Ringer.

Installez une électrode d’aspiration sur la chambre. Après avoir monté la chambre de préparation sur l’étage du microscope, placez les raccords d’entrée et de sortie dans la chambre. Activez un système entraîné par flux gravitaire pour éliminer l’excès de solution de la préparation.

Une fois cela fait, branchez l’électrode d’aspiration stimulante dans un stimulateur électrique et assurez-vous que les contractions musculaires se produisent après les stimuli. Ensuite, remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer contenant 10 micromolaires de d-tubocurarine et allumez la pompe d’aspiration de perfusion pour commencer la perfusion. Dans le microscope confocal à balayage laser, ou le logiciel LSCM, choisissez l’électrophysiologie et le mode d’acquisition pour définir les paramètres d’imagerie.

Dans les paramètres du menu de travail, sélectionnez les paramètres de déclenchement pour déclencher le stimulateur avec l’impulsion de synchronisation du microscope et réglez le déclencheur sur le champ d’image sur le canal OUT 1. Réglez le mode de balayage sur XYT à une fréquence de balayage de 1 400 hertz. Le facteur de zoom doit être de 6,1 avec le trou d’épingle complètement ouvert.

Assurez-vous que le mode X séquentiel, transcroisé et bidirectionnel est activé, puis définissez la durée minimale pour former une image à 52 millisecondes et collectez des images dans une vidéo brute à 20 images. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser argon à 488 nanomètres avec 8% de puissance de sortie. Lorsque les paramètres sont définis, appuyez sur le bouton du mode live pour obtenir un aperçu en direct des bornes nerveuses chargées avec le colorant.

En mode live, recherchez la région d’intérêt, ou ROI, pour obtenir la meilleure mise au point. Ensuite, décalez le retard sur le stimulateur de deux millisecondes de moins par rapport à la valeur précédente et exécutez le logiciel d’acquisition de données pour acquérir 26 séquences en décalant chaque séquence de deux millisecondes par rapport à la précédente. Pour traiter les vidéos capturées, exécutez le logiciel Leica Application Suite X ou LAS X et ouvrez le projet créé.

Ensuite, cliquez sur exporter et enregistrer sous pour enregistrer les images au format TIF dans le dossier de destination. Ensuite, exécutez le logiciel ImageJ et cliquez sur fichier, importer et séquence d’images. Dans la fenêtre d’ouverture de la séquence d’images, choisissez le dossier de destination et ouvrez la première image.

Dans les options de séquence, accédez au champ de l’image de départ et définissez le numéro d’image sur un pour la première image. Ensuite, dans le champ d’incrémentation, définissez la valeur égale au nombre d’images dans l’enregistrement initial du signal avant de cliquer sur OK. Pour enregistrer le fichier généré des premières images assemblées dans un dossier séparé, cliquez sur les onglets fichier, enregistrer et dossier dans l’ordre.

Répétez les procédures pour 19 images en définissant le numéro d’image correspondant dans le champ de l’image de départ. Lorsque toutes les images sont obtenues, cliquez sur fichier, importer et séquence d’images pour en sélectionner une dans les champs image de départ et incrément. La vidéo finale avec toutes les images assemblées à une résolution temporelle accrue peut être vue.

Ensuite, enregistrez le fichier vidéo au format TIF. Pour analyser la vidéo assemblée, cliquez sur l’image, les piles, les outils et le trieur de piles. Ensuite, accédez à l’analyse, aux outils et au gestionnaire de retour sur investissement.

Faites glisser et déposez le fichier TIF enregistré précédemment dans la fenêtre ImageJ, puis développez l’image pour une meilleure vue. Pour améliorer la visualisation de l’image, cliquez sur l’image, ajustez, pour transformer le contraste de luminosité en automatique. Définissez l’arrière-plan près de la terminaison nerveuse en dessinant un retour sur investissement et en ajoutant de la valeur au gestionnaire de retour sur investissement.

Ensuite, calculez l’arrière-plan en cliquant sur plus et multi mesurer. Copiez les valeurs moyennes à coller dans le tableur. Ensuite, calculez la valeur moyenne.

Ensuite, soustrayez la valeur moyenne calculée des piles en cliquant sur processus, principal et soustraire. Entrez la valeur obtenue et dessinez le ROI autour d’une borne nerveuse via une ligne polygonale avant de l’ajouter au gestionnaire de ROI. Mesurez l’intensité transitoire de la terminaison nerveuse en cliquant sur les onglets plus et multi-mesures.

Ensuite, copiez les valeurs d’intensité moyenne et collez-les dans le tableur pour calculer le décalage moyen des signaux. Divisez les valeurs du signal par la valeur de décalage moyenne. De la valeur obtenue, soustrayez-en un, puis multipliez par 100%, puis tracez un graphique transitoire de calcium pour déterminer l’amplitude.

Après avoir chargé la préparation nerveuse avec un colorant, la majeure partie de la synapse est située près du moignon nerveux, indiquant un niveau suffisant de fluorescence. Après le traitement de l’image, le calcium transitoire avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée a été obtenu. L’une des étapes les plus importantes de ce protocole est que le moignon nerveux doit être placé dans la solution contenant le colorant dans les premières minutes après la coupe du nerf.

Cette méthode peut être utilisée pour charger divers colorants et médicaments dans les motoneurones. Le protocole d’enregistrement peut être utile pour évaluer le calcium dans les dendrites et les épines dans les préparations du SNC. Notre technique permet d’enregistrer un signal de calcium avec une bonne résolution spatiale et temporelle.

L’étude de la céphatrience calcique est un outil puissant dans la recherche sur la régulation de la libération d’un neurotransmetteur et de la plasticité synaptique.