Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Les interactions leucocytaires-endothéliales jouent un rôle important dans les maladies inflammatoires telles que la septicémie. Le dérèglement de l’inflammation provoque souvent une altération de la fonction de barrière de l’endothélium vasculaire et un trafic excessif de leucocytes, ce qui peut entraîner des dommages aux organes. Le test microfluidique biomimétique, ce que nous appelons bMFA, reproduit la topographie et les conditions d’écoulement des réseaux microvasculaires in vivo et permet une évaluation en temps réel du roulement, de l’adhérence ferme, de l’étalement et de la migration des neutrophiles dans le compartiment tissulaire.

L’une des forces du test microfluidique biomimétique est la capacité d’utiliser des cellules humaines primaires et des échantillons de patients cliniquement pertinents pour augmenter la traduction clinique et dépister rapidement les traitements potentiels. M. Qingliang Yang, un assistant de recherche diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures. Commencez à insérer le tube d’environ un pouce de longueur dans les ports à l’aide de pinces fines, à l’exception d’un port d’entrée.

À l’aide de pinces à mâchoires, serrez les deux orifices de sortie et le compartiment tissulaire ensemble. Diluer la solution mère de fibronectine à 100 microgrammes par millilitre avec du PBS. Chargez une seringue d’un millilitre reliée à une aiguille émoussée de calibre 24 avec la solution de fibronectine diluée et connectez la seringue à un tube de quatre pouces de long.

Insérez le tube dans l’orifice d’entrée ouvert, puis poussez le piston jusqu’à ce que la fibronectine humaine soit libérée d’un autre orifice d’entrée et serrez-le. Répétez le processus pour les orifices restants jusqu’à ce que tous les canaux, le compartiment tissulaire et les tubes soient remplis de la solution de fibronectine humaine. Retirez l’aiguille, mais gardez le tube de quatre pouces de long inséré et non serré.

Pour effectuer le dégazage, connectez le tube non serré à l’apprêt pneumatique relié à un réservoir d’azote comprimé avec une pression de cinq livres par pouce carré pendant 15 minutes. Au microscope, vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans le canal ou le compartiment tissulaire et reconnectez l’appareil si les bulles d’air sont présentes. Retirez l’appareil de l’apprêt pneumatique et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant une heure.

À l’aide de milieux de culture de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines préchauffés, rincez tous les canaux et le compartiment tissulaire. Après avoir prélevé les cellules endothéliales comme décrit dans le manuscrit du texte, abattez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 150 fois G.In la pompe à seringue programmable, montez une seringue d’un millilitre et fixez le tube à l’aiguille émoussée. Aspirez environ 20 microlitres de la suspension cellulaire dans le tube sans la laisser entrer dans le barillet de la seringue.

Retirez la pince du port de sortie de l’appareil. Connectez le tuyau à l’orifice d’entrée sans introduire de bulle d’air dans le canal. Arrêtez la pompe avec un débit de quatre à huit microlitres par minute et observez au microscope.

Arrêtez la pompe lorsque les canaux sont remplis de cellules. Serrez la sortie et coupez le tube d’entrée. Placez l’appareil dans l’incubateur pendant quatre heures à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius.

Après quatre heures d’incubation, préparez une autre seringue et remplissez-la de milieux de culture cellulaire frais. Montez la seringue dans une pompe à seringue et connectez-la à l’orifice d’entrée. Retirez la pince du port de sortie.

Passez le média frais à travers l’appareil pendant environ cinq minutes à quatre à huit microlitres par minute pour retirer les cellules flottantes ou non attachées. Préparez une seringue en la remplissant de milieux de culture cellulaire frais. Montez la seringue dans une pompe à seringue et connectez-la à un orifice d’entrée tout en gardant l’orifice de sortie ouvert.

Placez l’appareil dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Programmez la pompe à seringue pour la culture des cellules endothéliales sous écoulement comme décrit dans le manuscrit du texte. À l’aide d’un microscope, vérifiez l’AMFb après 48 heures de culture sous écoulement.

La microscopie confocale a indiqué que toutes les surfaces des canaux vasculaires étaient recouvertes de cellules endothéliales, formant une lumière 3D complète en bMFA. Après avoir préparé trois dispositifs bMFA différents, chargez trois seringues d’un millilitre avec des milieux de culture cellulaire ou TNF-alpha ou TNF-alpha combinés à un inhibiteur du delta PKC respectivement, où le TNF-alpha et la cytokine inflammatoire sont utilisés pour stimuler les cellules endothéliales et les neutrophiles. L’inhibiteur du delta de la PKC est un nouvel inhibiteur anti-inflammatoire.

Connectez les trois seringues chargées à trois dispositifs bMFA. En utilisant le tampon TNF-alpha ou TNF-alpha avec inhibiteur ajouté, traiter les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines pendant quatre heures à 0,1 microlitre par minute. Après avoir isolé les neutrophiles humains comme décrit dans le manuscrit du texte, remettez en suspension les neutrophiles dans 999 microlitres de tampon HEPES et ajoutez un microlitre de solution mère de colorant CFDA SE de 10 millimolaires à la suspension, ce qui donne une solution de travail de 10 micromolaires de CFDA SE et incubéez-la pendant 10 minutes à température ambiante.

Lavez les cellules deux fois avec un tampon HEPES en centrifugant la solution pendant cinq minutes à 315 fois G.Après avoir compté les cellules, remettez en suspension à 2 millions de neutrophiles par millilitre dans un milieu de culture cellulaire ou TNF-alpha ou TNF-alpha ajouté avec un inhibiteur du delta PKC et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Remplissez la seringue avec un micromolaire d’un chimio-attractif, fMLP, préparé dans un milieu de culture cellulaire. Ouvrez un port d’entrée et un port de sortie du bMFA.

Retirez le tube d’orifice du compartiment à tissus et insérez le tube fMLP. Injecter environ 20 microlitres de fMLP dans le compartiment tissulaire pour tous les bMFA, en laissant celui traité avec des milieux de culture cellulaire. Coupez le tube et serrez-le.

Remplissez la seringue d’environ 200 microlitres de suspension de neutrophiles et montez la seringue sur la pompe à seringue. Après avoir placé l’appareil sur un étage de microscope inversé, réglez le débit à un microlitre par minute et démarrez la pompe. Attendez qu’une petite goutte de la suspension de neutrophiles sorte du tube et insérez le tube dans l’orifice d’entrée.

Les neutrophiles marqués par fluorescence s’écoulent dans les canaux vasculaires et interagissent avec les cellules endothéliales et les conditions d’écoulement physiologiquement pertinentes. Après 10 minutes après le début de l’expérience, ouvrez le logiciel d’analyse d’images, basculez l’objectif sur 10x et utilisez le joystick de scène pour centrer l’appareil sous le microscope. Pour obtenir la carte d’adhésion, accédez à Acquérir, cliquez sur Numériser une grande image.

Une nouvelle fenêtre apparaît. Choisissez objectif 10x et définissez l’option de champ, par exemple, 5 par 3. Cliquez sur Analyser, sur Fichier, puis enregistrez la carte d’adhésion.

Pour obtenir la carte de migration pour l’analyse de migration, centrez l’appareil sous le microscope à l’aide du joystick de scène. Cliquez sur Affichage, Contrôles d’acquisition, Acquisition ND. Une nouvelle fenêtre apparaît.

Définissez le chemin d’accès pour enregistrer le fichier et tapez le nom du fichier. Vérifiez la fonction Grande image, définissez la zone de numérisation, par exemple, 5 par 3. Vérifiez la fonction Heure, définissez l’intervalle sur cinq minutes et la durée sur 60 minutes.

Prenez des images en accéléré du compartiment tissulaire, avec une image prise toutes les cinq minutes pendant l’heure suivante. La simulation CFD montre le schéma d’écoulement laminaire dans les canaux vasculaires, à l’exception des zones de bifurcation où le schéma d’écoulement est perturbé. Après avoir effectué le test de microfluides biomimétiques, des images de contraste de phase ont révélé que les surfaces des canaux vasculaires étaient recouvertes de cellules endothéliales et alignées dans le sens de l’écoulement de cisaillement après 48 heures de culture.

L’imagerie par fluorescence a été réalisée à l’aide de la microscopie confocale, indiquant que les cellules endothéliales forment une lumière tridimensionnelle complète dans l’AGB Une carte d’adhésion des neutrophiles a été obtenue, ce qui a révélé qu’il existe une adhésion significative des neutrophiles aux cellules endothéliales dans l’AGB. La carte de migration des neutrophiles dans l’AMFb a révélé que lors de l’activation du TNF-alpha, une migration considérable des neutrophiles se produit à l’intérieur du compartiment tissulaire, alors qu’aucune migration de ce type n’a été observée sans activation du TNF-alpha. Une carte d’adhérence corrélant la distribution spatiale des neutrophiles avec la vitesse de cisaillement a démontré que l’adhésion des neutrophiles se produisait préférentiellement dans les navires à faible taux de cisaillement et près des régions de bifurcation.

En outre, le traitement TNF-alpha augmente significativement l’adhérence, qui a été inhibée avec l’inhibiteur du delta PKC. L’analyse des images en accéléré a indiqué que l’activation du TNF des cellules endothéliales augmente la migration des neutrophiles en réponse à la fMLP, tandis que le traitement avec l’inhibiteur du delta pkC réduit la migration par rapport aux cellules traitées au TNF-alpha. Ainsi, l’AGB peut être utilisée pour tester l’efficacité d’un nouveau traitement pour traiter les maladies inflammatoires.

Le bMFA peut également être utilisé pour étudier l’intégrité de l’endothélium en mesurant des variables telles que la perméabilité et la résistance électrique trans-endothéliale, ce qu’on appelle TEER, et l’expression des molécules d’adhésion pendant l’inflammation. Le test microfluidique biomimétique peut imiter le microenvironnement de différents organes et ne se limite pas à des types ou des espèces de cellules uniques, et peut également modéliser la communication cellule/cellule essentielle au fonctionnement des organes et à la modélisation de différentes maladies.