Name: Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Découvrez la livraison stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour l'α-synucléine humaine dans la substantia nigra chez la souris. Cette méthode reproduit la pathologie synucléine, l'activation microgliale et les déficits moteurs de la maladie de Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Sebastián Valenzuela et le Dr Micaela Ricca pour leur précieuse assistance vétérinaire dans notre établissement pour animaux. Ce travail a été soutenu par « Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID » Centro Ciencia & Vida, FB210008 (à la Fundación Ciencia & Vida), et le Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Ce travail a également été financé par les subventions FONDECYT-1210013 (à R.P.) et FONDECYT-1150766 (à F.C.) de « Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID) » et MJFF-10332.01 (à R.P.) et MJFF-17303 (à F.C.) de la Fondation Michael J Fox pour la recherche sur la maladie de Parkinson.

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence d’intérêts financiers ou non financiers concurrents.

Le modèle murin de neurodégénérescence analysé ici pourrait aider à étudier de nombreux aspects critiques impliqués dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson, y compris les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn et l’activation microgliale, l’implication du système immunitaire périphérique dans la régulation de la neuroinflammation et les mécanismes de la neurodégénérescence. Parmi les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn figurent les mécanismes subcellulaires associés à un dysfonctionnement mitochondrial, lysosomal ou protéasomal en présence d’une charge excessive d’αSyn dans les neurones dopaminergiques du SN2. Il est important de considérer que, en plus de l’expression hαSyn induite par la transduction médiée par l’AAV, la souris endogène αSyn contribue également à la charge d’expression totale d’αSyn. Les souris transgéniques surexprimant la souris αSyn développent une pathologie de la synucléine, une neuropathologie et une déficience motrice similaires à celles de ces modèles murins basées sur la surexpression de hαSyn32. En ce qui concerne l’activation microgliale, le présent modèle murin pourrait être utilisé pour étudier comment différents acteurs moléculaires et cellulaires tels que les cytokines, les neurotransmetteurs, les astrocytes, les neurones, la barrière hémato-encéphalique et les lymphocytes T pourraient réguler l’acquisition de phénotypes fonctionnels pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires 8,10,11 . Ce modèle constitue également un outil important pour étudier le rôle du système immunitaire périphérique, comprenant non seulement les lymphocytes T mais aussi les macrophages, les monocytes et les neutrophiles, sur les processus de neuroinflammation et de neurodégénérescence des neuronesnigrals 11,33,34. Enfin, ce modèle murin représente également un système précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neurodégénérescence in vivo, y compris ceux induits par des processus cellulaires internes, tels que le stress oxydatif, les déficits énergétiques et les organites endommagés 2, ou ceux exercés par des acteurs externes, tels que les facteurs neurotoxiques produits par les cellules microgliales, les astrocytes et les lymphocytes T cytotoxiques8, 28,29,35.
Une limitation de ce modèle murin est l’étude de la façon dont l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux pourrait constituer les premiers stades du développement de la maladie de Parkinson36. À cet égard, il existe de plus en plus de preuves indiquant que, avant la neurodégénérescence des neurones nigral et la déficience motrice, la pathologie αSyn commence dans la muqueuse intestinale et l’épithélium olfactif36 et, probablement, la réponse des lymphocytes T spécifiques à αSyn ainsi que12. Par la suite, les agrégats αSyn migreraient à travers le nerf vague vers le tronc cérébral, déclenchant la neuroinflammation et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques12. Bien que le modèle AAV-hαSyn récapitule la plupart des aspects de la maladie de Parkinson, il n’y a pas d’implication évidente de l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux dans ce modèle. Un modèle alternatif impliquant la pathologie hαSyn approprié pour étudier ces aspects de la maladie de Parkinson pourrait être des souris transgéniques surexprimant hαSyn sous le contrôle du promoteur Thy1, le modèle Thy1-SNCA 37, dans lequel le développement de la maladie dépend du microbiote intestinal et implique une déficience gastro-intestinale évidente38.
Bien qu’il soit utile pour l’étude des divers processus associés à la physiopathologie de la maladie de Parkinson, le présent modèle murin implique des étapes critiques qui doivent être minutieusement vérifiées, y compris la livraison correcte des vecteurs viraux dans les coordonnées spatiales correspondantes, l’expression sélective de hαSyn dans les neurones (qui dépend du sérotype AAV et de la construction vectorielle), et la dose et le moment appropriés de l’AAV avant d’analyser le phénotype parkinsonien. L’analyse de la bonne administration des vecteurs viraux dans le SN est nécessaire, car l’utilisation des coordonnées spatiales correctes du SN peut ne pas suffire lorsque l’aiguille n’est pas entièrement droite, ce qui est parfois imperceptible à l’œil humain. De plus, la diffusion des vecteurs AAV dépend du sérotypeAAV 39. Pour ces raisons, il est nécessaire d’effectuer des contrôles de qualité périodiques vérifiant l’administration et la diffusion correctes des vecteurs AAV-GFP injectés après l’observation de GFP dans des tranches de cerveau contenant la zone du SN.
En ce qui concerne l’expression sélective de hαSyn dans les neurones, en principe, l’expression de hαSyn pourrait être conçue pour être contrôlée par un promoteur sélectif pour les neurones ou, plus précisément encore, sélectif pour les neurones dopaminergiques, comme l’utilisation du promoteur TH dans les vecteurs AAV pour induire l’expression sélective des gènes dans les neurones dopaminergiques40 . Cependant, cette stratégie ne fonctionne pas lorsque ce qui est recherché est la surexpression du gène d’intérêt. Pour cette raison, dans le présent modèle, il est essentiel d’utiliser un promoteur fort (un promoteur induisant une forte expression du gène en aval) et des sérotypes AAV avec tropisme neuronal. Dans cette étude, le promoteur de l’ACA a été utilisé comme promoteur puissant pour induire la surexpression de hαSyn, et le sérotype AAV5 a été utilisé pour le vecteur viral. Ce sérotype a déjà été utilisé pour transduire les neurones de souris et de rats41,42. Ici, les résultats ont démontré que, 12 semaines après l’administration d’AAV5-GFP dans le SN de souris, la fluorescence verte était sélectivement présente sur le côté ipsilatéral du SN et du striatum (Figure 1), indiquant la transduction efficace des neurones de la voie nigrostriatale.
Un autre aspect critique de ce modèle murin de la maladie de Parkinson est le temps nécessaire pour analyser un processus particulier après la chirurgie. À cet égard, ce travail montre une étude cinétique des différents processus impliqués dans la pathologie. Étant donné que les points temporels clés changent avec la dose de génomes viraux administrée par souris, le sérotype d’AAV utilisé, ou même avec le lot d’AAV utilisé, une analyse dose-réponse de la quantité d’AAV-αSyn nécessaire pour induire une perte significative de neurones TH + et une déficience motrice a d’abord été effectuée. Des études antérieures ont montré une déficience motrice significative et une perte de neurones TH + de la voie nigrostriatale après 12 semaines d’injections d’AAV-αSyn chez la souris à des doses allant de 6 x 108–3 x10 10 génomes viraux par souris 16,17,30,31. En conséquence, la dose d’AAV-hαSyn utilisée pour induire l’expression de hαSyn dans la voie nigrostriatale, la perte de neurones TH+ et la déficience motrice chez la souris variait de 1 x 108–1 x 1010 génomes viraux par souris. De plus, pour contrôler que la perte de neurones TH+ et la déficience motrice étaient induites par la surexpression de hαSyn dans le SN et non par l’infection AAV des neurones du SN, des groupes témoins ont été inclus dans lesquels le codage AAV pour un gène rapporteur (AAV-eGFP) a été administré unilatéralement dans le SN de souris et la neurodégénérescence et la déficience motrice ont été déterminées. Les résultats ont montré que, 12 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 x 1010 génomes viraux par souris était une dose appropriée d’AAV5-hαSyn, car les souris recevant cette charge virale présentaient une hαSyn significative dans la voie nigrostriatale (Figure 2 et Figure 3), une perte de neurones TH+ (Figure 4) et une déficience motrice (Figure 5). En revanche, des doses plus faibles d’AAV5-hαSyn (1 x 108 génomes viraux par souris et 1 x 109 génomes viraux par souris) n’étaient pas assez fortes pour atteindre des changements significatifs dans tous ces paramètres ensemble (figures 2-4). Il est à noter que l’administration d’AAV-GFP à 1 x10 10 génomes viraux par souris a induit un degré faible (~20%), mais significatif de perte des neurones TH+ des neurones dopaminergiques nigrals (Figure 4A,B). Ce résultat concorde avec les observations précédentes utilisant ce modèle41 et est probablement la conséquence d’un faible niveau de neuroinflammation induit par l’administration de vecteurs AAV dans le SN. Néanmoins, l’étendue de la perte de neurones TH+ était significativement plus élevée chez les souris recevant AAV5-hαSyn par rapport à celles recevant la même dose d’AAV-GFP (Figure 4C). Il est à noter que la cinétique de l’expression de hαSyn dépend non seulement de l’efficacité de la transduction, mais aussi de l’étendue de la diffusion de l’AAV39. Étant donné que la diffusion de l’AAV dépend du sérotype de l’AAV, les points temporels clés précis de ce modèle animal peuvent varier lors de l’utilisation d’un autre sérotype d’AAV différent de l’AAV5.
Par la suite, une analyse cinétique a été réalisée en utilisant 1 x 1010 génomes viraux par souris pour déterminer les points temporels clés dans ce modèle murin. Étant donné que les preuves actuelles ont montré certains symptômes précoces qui apparaissent avant la déficience motrice, ce qui permettrait le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson 43,44, ces expériences ont cherché à trouver le moment où l’expression de hαSyn était déjà évidente, mais en l’absence de déficience motrice. Les résultats montrent que l’apparition de l’expression de hαSyn dans le SN a eu lieu 5 semaines après l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn (Figure 6). Ce point temporel constitue un point temporel intéressant pour commencer à administrer des thérapies adaptées pour arrêter les processus neuro-inflammatoires et neurodégénératifs. D’autres points temporels clés déterminés ici étaient les heures de pointe pour deux événements critiques associés au processus de neuroinflammation: le moment où la microglie atteint le degré maximal d’activation et le temps d’infiltration maximale des lymphocytes T dans le SN. Les résultats ont montré une courbe avec une tendance atteignant deux vagues d’activation microgliale maximale, la première à 10 semaines après la chirurgie et la seconde à 15 semaines après la chirurgie (Figure 7). L’analyse cinétique de l’infiltration des lymphocytes T a montré le pic d’infiltration du Treg dans le SN à 11 semaines après la chirurgie stéréotaxique (Figure 8). Étonnamment, aucun lymphocyte T effecteur (CD4+ Foxp3-) n’a été détecté infiltrant le SN au cours de la période analysée (semaines 8 à 13 après la chirurgie). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent un laps de temps approprié pour commencer à administrer des thérapies visant à arrêter le processus de neuroinflammation et à atténuer l’infiltration des lymphocytes T dans le SN à l’aide de ce modèle préclinique, qui varie entre la semaine 5 après la chirurgie (le début de la surexpression de hαSyn) et la semaine 10 après la chirurgie (la première vague de neuroinflammation et d’infiltration des lymphocytes T) (Figure 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figure 9: Résumé des principaux points temporels trouvés pour ce modèle animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Après la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue dans le monde. Les neurones primaires affectés dans la maladie de Parkinson sont ceux de la voie nigrostriatale, qui produisent de la dopamine et contrôlent le mouvement volontaire. En conséquence, le symptôme le plus caractéristique associé à ce trouble est la déficience motrice. Cette pathologie implique également le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont composés principalement de α-synucléine (αSyn)1, une protéine cytosolique associée aux terminaux présynaptiques. Des preuves ont montré que la génération d’inclusions pathogènes d’αSyn est déclenchée par un mauvais repliement ou par certaines modifications post-traductionnelles de cette protéine2.
Notamment, une relation étroite a été établie entre la pathologie αSyn et la perte de neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale dans la maladie de Parkinson humaine et les modèles animaux 3,4. Comprendre comment les agrégats αSyn sont générés et comment ils induisent la mort neuronale représente un défi important dans le domaine. Un groupe croissant d’études a montré que, en augmentant le stress oxydatif, le dysfonctionnement mitochondrial est l’une des principales causes de la génération d’agrégats αSyn2. En effet, plusieurs gènes associés au risque de maladie de Parkinson codent pour des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale, la morphologie et la dynamique 5,6. De plus, le dysfonctionnement lysosomal, qui entraîne l’accumulation de mitochondries dysfonctionnelles et d’αSyn mal repliés, constitue un autre événement majeur favorisant la génération d’agrégats αSyn7.
De nouvelles preuves ont indiqué que, une fois que les agrégats αSyn sont déposés dans le cerveau, ces protéines pathogènes stimulent les récepteurs de type toll (TLR) sur la microglie, déclenchant ainsi une activation microgliale et un environnement inflammatoire initial dans la substantia nigra (SN)8,9. En outre, les preuves indiquent que les agrégats αSyn sont capturés et présentés par les cellules présentatrices d’antigènes aux cellules T, induisant une réponse immunitaire adaptative spécifique à αSyn10,11. Ces lymphocytes T spécifiques d’αSyn s’infiltrent ensuite dans le cerveau et sont restimulés par des microglies activées, favorisant ainsi la sécrétion de facteurs neurotoxiques qui évoquent la mort neuronale 9,10. Fait intéressant, plusieurs sources de données ont suggéré que les agrégats αSyn sont générés d’abord dans le système nerveux entérique, puis transportés à travers le nerf vague jusqu’au tronc cérébral12.
Plusieurs modèles animaux de la maladie de Parkinson sont utilisés depuis de nombreuses années, y compris ceux induits par l’administration de substances neurotoxiques (c.-à-d. 6-hydroxydopamine, paraquat, roténone, 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) et ceux impliquant des conditions génétiques (c.-à-d. α-synucléine mutante, kinase répétée 2)13 mutante riche en leucine . Malgré les modèles impliquant une neurodégénérescence induite par les neurotoxines reproduisant certains aspects de la maladie de Parkinson, aucun d’entre eux ne récapitule tous les aspects essentiels de la maladie ou n’est pas progressif13. D’autre part, bien que les modèles génétiques murins impliquant l’expression de versions mutantes de la kinase répétitive 2 riche en leucine, les versions mutantes de la α-synucléine ou la surexpression de α-synucléine de type sauvage humain entraînent une déficience motrice et, dans certains cas, le développement d’une synucléinopathie, ils ne reproduisent pas la neurodégénérescence proéminente des neurones dopaminergiques nigraux, ce qui est un aspect essentiel de la maladie de Parkinson13, 14. Un troisième type de modèle animal de neurodégénérescence a réussi à répondre à la plupart des aspects essentiels de la maladie de Parkinson, l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés (AAV) codant pour la α-synucléine humaine (AAV-hαSyn)14,15. Il est important de noter que les AAV permettent la transduction des neurones avec une grande efficacité et à long terme dans le cerveau adulte des mammifères. En outre, il a été démontré que l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn dans le SN reproduit de nombreux aspects essentiels de la maladie, notamment la pathologie αSyn, l’activation microgliale, la neurodégénérescence et la déficience motrice 16,17,18,19,20. Cette étude présente une analyse de la façon dont la dose de vecteur viral et le temps après l’administration du vecteur viral affectent l’étendue de l’expression hαSyn, la neurodégénérescence et la neuroinflammation dans la voie nigrostriatale, ainsi que le degré de déficience motrice dans le modèle murin d’administration stéréotaxique unilatérale de hαSyn dans le SN.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3-GFP C57BL/6</td><td>mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>N° de stock :&nbsp ; 023800</td><td></td></tr><tr><td>Régime alimentaire pour rongeurs</td><td>de laboratoire LabDiet</td><td>pour rongeurs 5001</td><td>Régime standard pour rongeurs</td></tr><tr><td>Type sauvage C57BL/6 souris</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>N° de stock : 000664</td><td></td></tr><tr><td>VIRAL VECTORS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV5-CBA-&alpha ; Syn</td><td>Plateforme de vecteurs viraux de l’Université de l’Iowa</td><td>N/A Concentration</td><td>de stock à 10E13 vg/mL</td></tr><tr><td>AAV5-CBA-eGFP</td><td>Plateforme de vecteurs viraux de l’Université de l’Iowa</td><td>N/A</td><td>Concentration de stock à 9,5 x 10E12 vg/mL</td></tr><tr><td>><ANESTHÉSIQUES ET ANALGÉSIQUES FORTS</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>218082</td><td>1 % pour la chirurgie stéréotaxique</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Drag Pharma</td><td>CHE30</td><td>70 mg/Kg pour la chirurgie stéréotaxique</td></tr><tr><td>Sévoflurane</td><td>Baxter</td><td>VE2L9117</td><td>Pour avant perfusion transcardique</td></tr><tr><td>Tramadol</td><td>Drag Pharma</td><td>DPH134</td><td>30 mg/Kg toutes les 24 h</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Centrovet</td><td>EHL40</td><td>9 mg/kg pour la chirurgie stéréotaxique</td></tr><tr><td><fort>ÉQUIPEMENT</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faisceau</td><td>horizontal N</td><td>/A</td> fait maison <td>de 25 cm de long et 3 cm de large. La surface du faisceau a été recouverte d’une grille métallique (1 cm2).</td></tr><tr><td>Cryostate</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Nikon</td><td>S2800 Coolpix</td><td>Pour l’enregistrement des performances du test de faisceau</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Utilisé pour l’analyse IHC (section 4.4)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Utilisé pour l’analyse IF (section 5.3)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMI8</td><td>Utilisé pour l’analyse IF (section 5.7)</td></tr><tr><td>Nouveau Standard Stéréotaxique, souris</td><td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td><td>51500</td><td>Cadre stéréotaxique pour la chirurgie</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Masterflex</td><td>C-flex L/S16</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation</td><td>Olympus</td><td>U-RFL-T</td><td>Utilisé pour l’analyse IF (section 5.3)</td></tr><tr><td>Suture chirurgicale</td><td>Sylkam&reg ;, B Braun</td><td>C0760171</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 100 U</td><td>BD</td><td>324918</td><td>Pour l’anesthésie avant la perfusion transcardique, seringue à aiguille 29G</td></tr><tr><td>RN 5uL SYR SANS AIGUILLE</td><td>Hamilton</td><td>HA-7641-01</td><td>Pour l’inoculation de vecteurs viraux</td></tr><tr><td><forts>TAMPONS ET RÉACTIFS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aviden, Peroxydase Conjugate</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>189728</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de cryotrotection</td><td>fait maison</td><td>N/A</td><td>20 % de glycérine et 2 % de DMSO dans PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount -G T</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fait maison</td><td>N/A</td><td>0,125 M, pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampon inactivant la peroxydase</td><td>Fabriqué maison</td><td>N/A</td><td>0,03 % H2O2 dans du méthanol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Trizma</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>ANTIBODIES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (espaceur long) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>111065003</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-Lapin de la Chèvre (H+L)&nbsp ; Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Lapin IgG (H+L)&nbsp ; Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-Rat de chèvre (H+L)&nbsp ; Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>Lapin monoclonal anti-alpha-synucléine</td><td>Abcam</td><td>ab138501</td><td></td></tr><tr><td>Lapin monoclonal anti-Iba-1</td><td>Abcam</td><td>EPR16588</td><td></td></tr><tr><td>Lapin polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Lapin monoclonal anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>100402</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>6.0</td><td>Fos analyse des statistiques</td></tr><tr><td>ImageJ</td> National Institute of Health <td>N/A</td><td>Pour</td><td>l’analyse</td></tr><tr><td>d’images LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>Pour la capture d’images avec le microscope Leica</td></tr><tr><td>ProgRes Capture Pro</td><td>Jenoptik</td><td>N/A</td><td>Pour la capture d’images avec le microscope</td></tr> <tr>Olympus<td>VLC media player</td><td>VideoLAN Organisation</td><td>N/A</td><td>Pour l’analyse des tests comportementaux</td></tr></tbody></table>

analyse du modèle murin de la maladie de parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui implique la mort des neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale et, par conséquent, la perte progressive du contrôle des mouvements volontaires. Ce processus neurodégénératif est déclenché par le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont principalement constitués de α-synucléine. Plusieurs études ont indiqué que la neuroinflammation est nécessaire pour développer la neurodégénérescence associée à la maladie de Parkinson. Notamment, le processus neuro-inflammatoire implique l’activation microgliale ainsi que l’infiltration de lymphocytes T périphériques dans la substantia nigra (SN). Ce travail analyse un modèle murin de la maladie de Parkinson qui récapitule l’activation microgliale, l’infiltration des lymphocytes T dans le SN, la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux et la déficience motrice. Ce modèle murin de la maladie de Parkinson est induit par l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine de type sauvage humain (AAV-hαSyn) dans le SN. L’administration correcte de vecteurs viraux dans le SN a été confirmée à l’aide de vecteurs témoins codant pour la protéine fluorescente verte (GFP). Par la suite, la façon dont la dose d’AAV-hαSyn administrée dans le SN a affecté l’étendue de l’expression de hαSyn, la perte de neurones dopaminergiques nigrals et la déficience motrice ont été évaluées. De plus, la dynamique de l’expression de hαSyn, de l’activation microgliale et de l’infiltration des lymphocytes T a été déterminée tout au long du développement de la maladie. Ainsi, cette étude fournit des points temporels critiques qui peuvent être utiles pour cibler la pathologie de la synucléine et la neuroinflammation dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson.

Ce travail analyse la dose vectorielle et le temps d’exposition nécessaires pour induire la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la déficience motrice dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Ces vecteurs codant pour la α-synucléine humaine sont introduits dans la substantia nigra pour récapituler la pathologie de la synucléine associée à la maladie de Parkinson.

Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

L’objectif global de cette procédure est de reproduire la plupart des aspects essentiels de la maladie de Parkinson dans un modèle animal. L’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés, codant pour la synucléine humaine dans la substantia nigra. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui implique la mort du neurone dopaminergique, dans la voie nigrostriatale, et par conséquent, la progression de la perte de contrôle du mouvement volontaire.Ce processus neurodégénératif s’accompagne d’un dépôt d’agrégats protéiques dans le cerveau, qui sont principalement constitués de synucléine. De nouvelles preuves ont indiqué que les agrégats de synucléine peuvent stimuler des récepteurs de type toll sur la microglie, déclenchant ainsi une inflammation neurale dans la substantia nigra. En outre, les preuves indiquent que les agrégats de synucléine peuvent être capturés et présentés, par des cellules présentatrices d’antigènes aux cellules T, induisant une réponse immunitaire adaptative spécifique à la synucléine.L’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour la synucléine humaine dans la substantia nigra a montré qu’elle reproduisait de nombreux aspects essentiels de la maladie, notamment la pathologie de la synucléine, l’activation microgliale, l’activation des lymphocytes T, la neurodégénérescence et la déficience motrice. Cette étude présente une analyse de la façon dont un vecteur viral et le temps après l’administration du vecteur viral, affecte l’étendue de l’expression de la synucléine humaine, la neurodégénérescence et la neuroinflammation dans la voie nigrostriatale, ainsi que le degré de déficience motrice dans un modèle murin d’administration stéréotaxique unilatérale de synucléine humaine dans la substantia nigra. Pour maintenir un environnement aseptique, portez des vêtements chirurgicaux appropriés pendant toute la chirurgie, y compris des couvre-chaussures, un masque chirurgical, une barrière sanitaire, des gants et une casquette chirurgicale.Vaporisez de l’éthanol sur la souris et tout le matériel chirurgical pour maintenir l’environnement aseptique. Pour induire une analgésie, injecter du carprofène par voie sous-cutanée toutes les 12 heures, en commençant une heure avant la chirurgie et en continuant jusqu’à trois jours après la chirurgie. Pour anesthésier la souris, placez l’animal dans une chambre à induction.Ouvrez le débit d’isoflurane à une vitesse de 0,5%, puis augmentez-le lentement jusqu’à 5% sur environ cinq minutes jusqu’à ce que la souris ait perdu son réflexe de redressement. Retirez l’animal de la chambre d’induction. Transférez immédiatement l’animal dans un circuit non respirant avec un cône de nez de taille appropriée.Maintenir l’anesthésie de la souris, avec de l’isoflurane 1% pendant toute la durée de la chirurgie. Vérifiez que la souris est entièrement anesthésiée en pinçant sa queue et ses pattes. Lorsque la souris ne réagit pas en pinçant la queue et les pattes, cela signifie que la souris est complètement anesthésiée.Rasez la tête de la souris à l’aide de ciseaux. Nettoyez la peau de la souris à l’aide d’un coton-tige avec de la chlorhexidine 2% et enlevez tous les poils. Fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique.Placez un protecteur cornéen dans les deux yeux de souris, à l’aide d’un coton-tige. Pour prévenir l’induction du stress chez d’autres rongeurs, évitez la présence de toute autre souris dans la salle de chirurgie. Nettoyez la tête de la souris avec trois tours de chlorhexidine 2% suivis d’éthanol 70%Exposez le crâne à l’aide de matériel chirurgical et faites un trou mince avec une perceuse aux coordonnées antéropostérieures 2,8 mm et médiolatérales 1,4 mm, par rapport à la ligne médiale.Mettez l’aiguille d’une seringue de 10 microlitres dans le trou et déplacez l’aiguille à l’intérieur du cerveau lentement, jusqu’à ce qu’elle atteigne 7,2 mm dorsoventral, par respect pour la dure-mère. Laissez l’aiguille en position finale pendant deux minutes, pour permettre au tissu de se déposer un peu, puis injectez un microlitre de vecteurs viraux dans la substantia nigra droite, à raison de 0,2 microlitre toutes les 30 secondes. Laissez l’aiguille dans la même position pendant cinq minutes après l’administration des vecteurs viraux, puis retirez-la lentement.Fermez la plaie à l’aide d’une suture de soie stérile. Mettez la souris dans la cage de la maison, préchauffée en la plaçant sur un matelas chaud électrique. 12 semaines après la chirurgie stéréotaxique, évaluez les performances motrices à l’aide d’une version simplifiée du test de faisceau, décrite précédemment.À cette fin, utilisez une poutre horizontale de 25 cm de longueur et 3 cm de largeur. La surface de la poutre doit être recouverte d’une grille métallique avec des carrés d’un centimètre et surélevée d’un centimètre au-dessus de la poutre. Faites une vidéo de la souris, tout en traversant le faisceau de surface de la grille, d’une extrémité à l’autre extrémité de la poutre, où se trouve la cage de la maison.Entraînez la souris pendant deux jours, avant la détermination des performances du moteur. Le premier jour, entraînez la souris à traverser le faisceau cinq fois, sans la grille. Le deuxième jour, entraînez la souris à marcher à travers le faisceau, en présence de grille cinq fois.Le troisième jour, évaluez les performances du moteur. Pour ce faire, quantifiez le nombre d’erreurs effectuées, par les pattes gauches ou par les pattes droites séparément, en regardant les vidéos en mode ralenti. Pour anesthésier la souris, injecter un mélange de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale.Une fois que la souris est complètement anesthésiée, ouvrez le thorax avec du matériel chirurgical et exposez le cœur. Insérez ensuite une aiguille à pointe plate dans le ventricule gauche du cœur. En couplant l’aiguille à un tuyau, perfuser 50 millilitres de solution saline tampon phosphate, à raison de 9,5 millilitres par minute, à l’aide d’une pompe péristaltique.Retirez le cerveau à l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, puis fixez-le par immersion, dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4%, dans une solution saline tampon phosphate. Ensuite, mettez le cerveau fixe, dans 15 millilitres de saccharose à 30% pendant 48 heures. Ensuite, mettez le cerveau dans quatre millilitres de solution de cryoprotection et sauvez le cerveau à 80 degrés, ou utilisez-le immédiatement à l’étape suivante.Pour obtenir des tranches striatales, coupez le cerveau en sections de 40 micromètres d’épaisseur, en commençant à 1,34 mm et en terminant à 0,26 mm. Récoltez chaque tranche dans un cryotube de deux millilitres, selon l’ordre antéropostérieur. Pour effectuer une analyse immunohistochimique et immunofluorescente dans le striatum, choisissez cinq sections striatales coronales prises à intervalles uniformes, qui couvrent toute l’étendue rostrocaudale du noyau.Pour valider l’administration correcte de vecteurs viraux dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, des vecteurs codant pour la GFP ont été injectés, dans la substantia nigra, et 12 semaines plus tard, la fluorescence GFP et l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase ont été analysées dans la substantia nigra et le striatum par immunofluorescence. La fluorescence associée à la GFP a été localisée exclusivement dans le site ipsilatéral, et une colocalisation significative avec l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase a été observée à la fois dans la substantia nigra et le striatum, indiquant l’administration correcte de vecteurs viraux dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale. Pour tester la dose de vecteurs, codant pour la synucléine nécessaire, afin d’induire une surexpression significative de la synucléine humaine qui favorise la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux, différentes doses des vecteurs ont été injectées.Et 12 semaines plus tard, l’immunoréactivité de la synucléine humaine et l’étendue de l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase ont été testées dans la voie nigrostriatale. L’immunoréactivité de la synucléine humaine était évidente, toutes les doses ayant été testées dans la substance noire. Cependant, seules les souris recevant de 10 à 10 génomes viraux par souris présentaient une immunoréactivité évidente de la synucléine humaine dans le striatum.Les souris recevant 10 à 10 génomes viraux par souris de vecteurs codant pour la synucléine humaine, ont montré une perte significative de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra. Bien que les souris recevant la même dose de vecteurs codant pour la GFP présentaient un faible degré de perte neuronale, ces souris présentaient un degré de neurodégénérescence significativement plus faible, par rapport aux souris recevant des vecteurs, codant pour la synucléine humaine. En utilisant le test au faisceau, une réduction significative des performances motrices a été détectée exclusivement chez ces souris, recevant 10 à 10 génomes viraux par souris de vecteurs codant pour la synucléine humaine, lors de la comparaison du nombre d’erreurs commises par les pattes droite et gauche, ou lors de la comparaison du nombre total d’erreurs, de souris recevant des vecteurs codant pour la synucléine humaine, avec ces souris recevant le vecteur témoin.Pour définir le début de l’expression de la synucléine humaine, les souris ont été traitées avec 10 à 10 génomes viraux par souris, de vecteurs codant pour la synucléine humaine, ou chirurgie simulée, et l’étendue de l’expression de la synucléine humaine a été analysée dans la substantia nigra, une fois par semaine, pendant les semaines deux à cinq après la chirurgie stéréotaxique. Les résultats montrent que l’expression de la synucléine humaine a commencé à être évidente à la cinquième semaine après la chirurgie stéréotaxique. Pour déterminer le pic d’activation microgliale, l’étendue des cellules exprimant des niveaux élevés d’Iba1 a été quantifiée dans le striatum de souris, pendant les semaines 2 à 15 après la chirurgie.Les résultats montrent une augmentation significative de l’activation microgliale du côté ipsilatéral, par rapport au côté controlatéral des souris, 15 semaines après l’inoculation virale. Le nombre de lymphocytes T régulateurs infiltrés dans le nigra substantiel a été analysé à différents moments, après la chirurgie stéréotaxique par immunofluorescence, suivie d’une observation par microscopie confocale. Le pic d’infiltration des lymphocytes T régulateurs dans la substantia nigra a été observé à la semaine 11 après la chirurgie.Le modèle murin de neurodégénérescence analysé ici, représente un modèle utile pour étudier les nombres d’aspects clés impliqués dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson. Mécanismes d’implication impliqués dans la pathologie de la synucléine, l’activation microgliale, l’implication du système immunitaire périphérique, dans la neuroinflammation et les mécanismes de la neurodégénérescence Une dose appropriée de vecteur viral adéno-associé, sous-type cinq codant pour la synucléine humaine pour induire la neurodégénérescence, la neuroinflammation, l’infiltration des lymphocytes T et la déficience motrice, est de 10 à 10 génomes viraux par souris. Cette étude montre que cinq semaines après la chirurgie stéréotaxique, constitue un moment clé, dans lequel l’expression de la synucléine humaine était déjà évidente, mais en l’absence de déficience motrice dans ce modèle animal.Ainsi, ce point temporel représente un point temporel intéressant, pour commencer l’administration de thérapies expérimentales adaptées pour arrêter la progression de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Le moment le plus approprié pour analyser la neuroinflammation dans ce modèle animal est la semaine 15 après une chirurgie stéréotaxique. Bien qu’il s’agisse d’un bon moment pour analyser l’infiltration des lymphocytes T dans le système nerveux central.semble être à la semaine 11 après l’inoculation du vecteur viral.

analyzing-parkinson-s-disease-mouse-model-induced-adeno-associated

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

La maladie de Parkinson est causée par la perte de l'innervation dopaminergique dans le striatum, qui peut être induite expérimentalement par la 6-OH-dopamine. Nous décrivons comment effectuer une lésion stéréotaxique et de surveiller l'apomorphine induit un comportement de rotation chez la souris. Ce modèle est utile et fiable pour les tests de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson.

Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental

Cette vidéo montre le processus d'injection d'un vecteur viral dans la substance noire du rat pour modéliser la maladie de Parkinson. Il décrit les étapes de préparation du rat, de micro-injection du vecteur viral dans la substance noire et la procédure de récupération.

Injection d’un vecteur viral dans la substance noire du rat pour la modélisation de maladies neurodégénératives

Dans la maladie et le mouvement des troubles de Parkinson en général, les analyses comportementales sensibles et fiables sont essentielles pour tester de nouvelles thérapies potentielles. Ici, nous décrivons une batterie de tests sensori gérable pour les souris qui sont sensibles à des degrés divers de lésions au système nigrostriatal et utile pour les études précliniques.

L&#39;évaluation de la fonction sensori-motrice chez des souris modèles de la maladie de Parkinson

Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.

Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

Ce manuscrit décrit comment l’administration locale de gènes par vecteur viral offre un moyen attrayant d’exprimer des transgènes dans le système nerveux central.  Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire du rat afin de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Une méthode pratique de perfusion par gravité pour l’analyse histologique du système nerveux central de la souris est présentée. La détection immunofluorescente de la α-synucléine phosphorylée est démontrée dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ce travail décrit également de manière exhaustive les étapes de perfusion transcardique, de dissection, de congélation /intégration des tissus et de sectionnement congelé.

Une méthode de perfusion transcardique alimentée par gravité pour l’analyse histologique du système nerveux central de la souris

Nous présentons ici l'injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel.

Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

Découvrez la livraison stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour l'α-synucléine humaine dans la substantia nigra chez la souris. Cette méthode reproduit la pathologie synucléine, l'activation microgliale et les déficits moteurs de la maladie de Parkinson.

Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine

Explorer plus de vidéos