Name: qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Découvrez un protocole de gélification pour produire des réactions qPCR prêtes à l'emploi dédiées à la détection de l'ADN de Trypanosoma cruzi. Cette méthode réduit le temps de préparation et minimise les erreurs opérateur.

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Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à Aline Burda Farias pour l’assistance technique avec le four à vide, ainsi qu’à l’administration de l’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brésil) pour avoir permis l’accès audit équipement. Ces travaux ont été partiellement financés par la subvention CNPq 445954/2020-5.

1. Préparation des solutions mères et du mélange de gélification
REMARQUE : Quatre solutions mères seront préparées (400 mg/mL de mélezitose, 400 mg/mL de tréhalose, 0,75 mg/mL de lysine et 200 mg/mL de glycogène) et mélangées selon la proportion indiquée au tableau 1 pour produire le mélange de gélification. Bien que le protocole décrive 10 ml de production de solutions mères, il peut être adapté à des volumes plus ou moins élevés.
<ol><li>Solution de mélezitose<ol><li>Peser 4 g de mélezitose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vorter à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous).</li>
		<li>Porter le volume final à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de tréhalose<ol><li>Peser 4 g de tréhalose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous).</li>
		<li>Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de glycogène<ol><li>Peser 2 g de glycogène dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous).</li>
		<li>Maintenir la solution au repos à 2-8 °C pendant 8-12 h car la solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles (Figure 1). Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de lysine<ol><li>Peser 7,5 mg de lysine dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau sans nucléase. Vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous).</li>
		<li>Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C pendant une période allant jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Mélange de gélification (GM)<ol><li>Dans un tube en plastique de 50 mL, mélanger les volumes de solutions mères conformément au tableau 1.</li>
		<li>Mélanger les réactifs par dix inversions bout à bout du tube. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’effectuer une étape de filtration si cette étape est effectuée dans une hotte de sécurité à flux laminaire. Si cette étape n’est pas effectuée dans un environnement propre, filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm avant de la transférer dans une fiole ambrée.</li>
		<li>Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 3 mois. REMARQUE : À titre d’étape de contrôle de la qualité pour la préparation du mélange de gélification, s’assurer que les valeurs mesurées de pH, de conductivité et de densité se situent dans les plages suivantes : pH 5,55-6,66; conductivité 0,630-0,757 mS/cm; et densité 1,08-1,11 g/cm3. Toutes les mesures doivent être effectuées à 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation du mélange maître qPCR pour la gélification
REMARQUE: Dans cette étape, le mélange maître qPCR pour la gélification est préparé. Par conséquent, de l’eau n’est pas ajoutée au mélange, mais le mélange de gélification est ajouté (tableau 2).
<ol><li>Décongeler les réactifs dans un contenant réfrigéré. Mélanger les réactifs dans un tube de 1,5 mL conformément au tableau 2. Un exemple de réaction avec un volume final de 25 μL contenant 5 μL d’échantillon d’ADN est montré ici. NOTE: L’échantillon d’ADN n’est pas ajouté au mélange à cette étape; il est utilisé ici uniquement pour calculer les volumes finaux de chaque réactif du mélange maître qPCR. Des échantillons d’ADN doivent être ajoutés juste avant le début de l’exécution (voir l’étape 4 ci-dessous).</li>
</ol>3. Gélification des réactifs sur les cuves de réaction
<ol><li>Multiplier de façon appropriée les volumes indiqués au tableau 2 pour la préparation d’une bande à huit tubes ou d’une plaque à 96 puits.</li>
	<li>Piper 18,5 μL du mélange maître de gélification illustré au tableau 2 sur chaque puits de réaction. REMARQUE : Ce volume représente les volumes de mélange d’oligonucléotides, de tampon PCR et de mélange de gélification utilisés pour une réaction (selon le tableau 2) et varie en fonction de la concentration des réactifs et du volume nécessaire pour une réaction. Le volume final du mélange principal de gélification est différent du volume d’un mélange maître régulier parce que de l’eau n’est pas ajoutée.</li>
	<li>Placez les tubes ou la plaque dans le support conducteur de chaleur (p. ex. aluminium) à l’intérieur du four à vide. REMARQUE: Le support thermoconducteur est facultatif. L’opérateur doit s’assurer que le fond des tubes est en contact avec l’étagère du four à vide pour permettre un équilibre thermique rapide.</li>
	<li>Placez un sac d’argile bentonite pour deux assiettes de 96 puits. NOTE: Les sacs d’argile bentonite sont utilisés pour absorber l’eau retirée du mélange principal de gélification par la pression différentielle exercée par le vide. Les sacs d’argile bentonite se sont avérés inutiles pour moins de deux plaques de 96 puits.</li>
	<li>Soumettre les tubes/plaques contenant le mélange principal de gélification à trois cycles de vide (30 ± 5 mBar) de 30 min chacun, en alternance avec la libération sous vide jusqu’à ce que la pression atmosphérique soit atteinte (900-930 mBar), sous température contrôlée (30 °C ± 1 °C) (figure 2). REMARQUE : L’instrument utilise un logiciel pour contrôler les paramètres, et un exemple du cycle est illustré à la figure 2. L’utilisateur doit créer le profil pour l’exécution, en indiquant les paramètres choisis.</li>
	<li>Une fois le cycle terminé, vérifier la gélification des réactifs dans les tubes/plaques en s’assurant que le volume est visiblement réduit (Figure 3) et que les liquides ne bougent pas en tapotant les tubes/plaques avec les doigts. REMARQUE : Si aucune gélification ne se produisait, la solution éclaboussait les parois des tubes lorsque les tubes sont taraudés (figure 3).</li>
	<li>Sceller et conserver les tubes/plaques à 2-8 °C pendant 8-12 h avant utilisation.</li>
</ol>4. Utilisation d’une qPCR gélifiée
<ol><li>Retirez la bande ou la plaque tubulaire du réfrigérateur et ouvrez-la dans un poste de travail pour la manipulation des échantillons. Ajouter 15 μL d’eau exempte de nucléases dans chaque cuve de réaction. NOTE: Le volume de réactifs gélifiés est considéré comme étant d’environ 5 μL. Ainsi, avec le volume de l’échantillon d’ADN (voir ci-dessous), le volume de réaction final est de 25 μL.</li>
	<li>Ajouter 5 μL d’échantillon d’ADN. REMARQUE: N’importe quel modèle d’ADN de qualité qPCR peut être utilisé. Dans le présent travail, l’ADN a été extrait de 10 épimastigotesdeT. cruzi (souche Dm28c) et a été dilué en série à un rapport de 1:10 à l’aide d’un tampon TE.</li>
	<li>Scellez les tubes/plaques et passez à l’équipement de votre choix. Exécutez l’expérience et procédez à une analyse régulière des données.</li>
</ol>

<ol><li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carlos+Chagas+%281879-1934%29%3A+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+%28foot-notes+to+the+history+of+Chagas%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li>
<li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li>
<li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas%27+disease+as+a+foodborne+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li>
<li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li>
<li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li>
<li>Ramírez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li>
<li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li>
<li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li>
<li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+%28Trypanosoma+cruzi+Loopamp%29+kit+for+detection+of+congenital%2C+acute+and+Chagas+disease+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).</li>
<li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li>
<li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).</li>
<li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).</li>
<li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li>
<li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li>
<li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Waterborne+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li>
<li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158(2014).</li>
<li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li>
<li>Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures%2C+which+are+totally+or+partially+dried%2C+comprising+at+least+one+enzyme%2C+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22PubChem%22%5BJournal%5D)">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li>
<li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings%3A+A+proof+of+concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).</li>
<li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li>
<li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria%3A+comparison+with+microscopy%2C+rapid+diagnostic+test%2C+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li>
<li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease%3A+up+to+date+and+novel+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ces dernières années ont mis en évidence la nécessité de trouver des technologies plus sensibles et spécifiques pour aider à diagnostiquer les maladies tropicales et négligées. Bien qu’importants pour le contrôle épidémiologique, les tests parasitologiques (microscopie optique) et sérologiques ont des limites, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et l’applicabilité au point de service. Les techniques d’amplification de l’ADN telles que la PCR, l’amplification isotherme et les variations respectives sont utili...

La maladie de Chagas a été découverte au début du 20èmesiècle dans les régions rurales du Brésil, où la pauvreté était répandue 1,2. Même aujourd’hui, la maladie continue d’être liée aux déterminants sociaux et économiques de la santé dans les Amériques. La maladie de Chagas est biphasique, comprenant une phase aiguë et une phase chronique. Elle est causée par une infection par le parasite Trypanosoma cruzi, transmise par des insectes vecteurs, des transfusions sanguines par voie congénitale ou l’ingestion orale d’aliments contaminés 3,4.
Le diagnostic de la maladie de Chagas peut être effectué par l’observation des symptômes cliniques (en particulier le signe Romaña), la microscopie par frottis sanguin, la sérologie et les tests moléculaires tels que la PCR en temps réel (qPCR) ou l’amplification isotherme 4,5,6,7,8,9. Les symptômes cliniques et la microscopie par frottis sanguin sont utilisés dans les cas suspects d’infections aiguës, tandis que la recherche d’anticorps est utilisée comme outil de dépistage chez les patients asymptomatiques. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité, il a été suggéré que la qPCR soit utilisée comme outil de surveillance pour les patients chroniques, pour les patients en phase aiguë subissant un traitement mesurant la charge parasitaire dans le sang et comme marqueur de substitution de l’échec thérapeutique 6,8,10,11,12 . Bien que plus sensibles et spécifiques que les tests actuellement disponibles, la qPCR est effectivement empêchée d’être connue comme outil de diagnostic dans les régions défavorisées du monde entier en raison de l’exigence de températures de congélation pour le transport et le stockage13,14,15.
Pour contourner cet obstacle, des techniques de conservation telles que la lyophilisation et la gélification ont été explorées16,17. Bien que la lyophilisation assure la conservation pendant des années, elle nécessite des réactifs spécialement fabriqués sans la présence de glycérol, qui est couramment utilisé pour la stabilisation / conservation des enzymes18. Bien qu’il ait été démontré que la gélification assure la conservation pendant des mois, elle permet l’utilisation de réactifs réguliers19. La solution de gélification comprend quatre composants, chacun ayant des rôles spécifiques dans le processus: les sucres tréhalose et mélézitose protègent les biomolécules pendant le processus de dessiccation en réduisant les molécules d’eau libre dans la solution, le glycogène produit une matrice protectrice plus large et l’acide aminé lysine est utilisé comme piégeur de radicaux libres pour inhiber les réactions oxydantes entre le carboxyle de la biomolécule, groupes amino et phosphate. Ces composants définissent un mélange sol-gel qui empêche la perte de la structure tertiaire ou quaternaire pendant le processus de dessiccation, aidant ainsi à maintenir l’activité des biomolécules lors de la réhydratation19. Une fois stabilisées à l’intérieur des tubes de réaction, les réactions peuvent être conservées pendant quelques mois à 2-8 °C ou quelques semaines à 21-23 °C au lieu des -20 °C normales. Cette approche a déjà été intégrée dans des tests conçus pour aider à diagnostiquer des maladies telles que la maladie de Chagas, le paludisme, la leishmaniose, la tuberculose et la cyclosporose13,14,15,20.
Le présent travail décrit toutes les étapes pour préparer les solutions requises pour la procédure de gélification, les pièges du processus et l’aspect final attendu d’une qPCR gélifiée prête à l’emploi à l’intérieur de bandes à huit tubes. Le même protocole peut être adapté pour les tubes simples ou les plaques à 96 puits. Enfin, la détection de l’ADN de T. cruzi sera présentée sous forme de contrôle.

<table><tbody><tr><td>Sacs d’argile bentonite (activé)</td><td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelone, Espagne)</td><td>026157/STD</td><td>À ne pas confondre avec les packs de gel de silice</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Amersham Bioscience</td><td>Cat# US16445 Lysine</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acros Organic</td><td>Cat# 365650250</td><td></td></tr><tr><td>Melezitoze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 63620</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td> <td>sans nucléasesfournisseur</td><td></td><td></td>privilégié</tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>fournisseur</td><td></td><td></td>privilégié</tr><tr><td>PCR mastermix</td><td>fournisseur privilégié ou Instituto de Biologia Molecular do Paran&aacute ; (IBMP, Curitiba, Brésil)</td><td>Chagas NAT kit</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycleur</td> logiciel <td>préféré</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pour four à vide</td><td>Memmert Gmbh</td><td>Celsius v10.0</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9531</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma cruzi</td><td>ADN de parasites cultivés en interne, ou acheté auprès de fournisseurs accrédités tels que ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Four sous vide</td><td>Memmert Gmbh</td><td>VO-400</td><td></td></tr></tbody></table>

qpcr prête à l’emploi pour la détection de l’adn de trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

La PCR en temps réel (qPCR) est une technique remarquablement sensible et précise qui permet d’amplifier des quantités infimes de cibles d’acides nucléiques à partir d’une multitude d’échantillons. Il a été largement utilisé dans de nombreux domaines de recherche et a atteint une application industrielle dans des domaines tels que le diagnostic humain et la sélection de caractères dans les cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM). Cependant, la qPCR n’est pas une technique à l’épreuve des erreurs. Le mélange de tous les réactifs en un seul mélange maître distribué par la suite sur 96 puits d’une plaque qPCR ordinaire peut entraîner des erreurs de l’opérateur telles qu’un mélange incorrect des réactifs ou une distribution inexacte dans les puits. Ici, une technique appelée gélification est présentée, par laquelle la majeure partie de l’eau présente dans le mélange maître est remplacée par des réactifs qui forment un mélange sol-gel lorsqu’ils sont soumis à un vide. En conséquence, les réactifs qPCR sont efficacement conservés pendant quelques semaines à température ambiante ou quelques mois à 2-8 °C. Les détails de la préparation de chaque solution sont présentés ici avec l’aspect attendu d’une réaction gélifiée conçue pour détecter l’ADN satellite de T. cruzi (ADNsatellite). Une procédure similaire peut être appliquée pour détecter d’autres organismes. Le démarrage d’une qPCR gélifiée est aussi simple que de retirer la plaque du réfrigérateur, d’ajouter les échantillons à leurs puits respectifs et de commencer l’exécution, réduisant ainsi le temps de configuration d’une réaction sur plaque complète au temps nécessaire pour charger les échantillons. De plus, les réactions PCR gélifiées peuvent être produites et contrôlées pour la qualité par lots, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs courantes de l’opérateur lors de l’exécution de réactions PCR de routine.

Trois des réactifs qui forment le mélange de gélification sont facilement solubilisés lors d’un tourbillon vigoureux. Cependant, le glycogène nécessite un tourbillon minutieux pour s’assurer que la poudre a été complètement solubilisée. Malheureusement, un tourbillon vigoureux produit beaucoup de bulles, ce qui rend difficile la détermination du volume réel de la solution (Figure 1A-B). Par conséquent, il est essentiel de laisser la solution de glycogène rep...

Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Le protocole de gélification produit des réactions qPCR prêtes à l’emploi qui diminuent le temps et les étapes nécessaires pour commencer une course. Ce protocole permet de produire et de contrôler la qualité et les grandes quantités des réactions qPCR à la fois, ce qui réduit les risques d’erreur de l’opérateur lors des calculs de recette ou de l’aliquote dans les puits. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle qPCR déjà entièrement optimisée dans le format congelé conventionnel.La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que deux des principales étapes du contrôle de la qualité sont visuelles. Pour préparer la solution de mélezitose, pesez quatre grammes de mélezitose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et tourbillonnez à la vitesse maximale jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Faire le volume final à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase, puis étiqueter et stocker la solution à deux à huit degrés Celsius jusqu’à six mois.Pour préparer la solution de tréhalose, pesez quatre grammes de tréhalose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la technique de PCR numérique duplex (ddPCR), une modification de la technique PCR traditionnelle qui est utile pour détecter simultanément deux marqueurs génétiques différents. Une seule réaction de PCR est divisée en gouttelettes émulsionnées de la taille d’un nanolitre qui sont amplifiées indépendamment, et la détection de signaux d’amplification de fluorescence de couleurs différentes à partir de la fraction de gouttelettes est utilisée...

PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles

Ce protocole décrit la détection par qPCR du cytomégalovirus dans le tissu de biopsie fixé au formol et inclus dans la paraffine, qui est rapide, sensible, spécifique et utile pour interpréter les modèles équivoques d’hématoxyline et d’éosine ou de coloration immunohistochimique.

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

L’ajout d’une étiquette à une protéine est un moyen puissant de mieux comprendre sa fonction. Ici, nous décrivons un protocole permettant de marquer de manière endogène des centaines de protéines de Trypanosoma brucei en parallèle afin que le marquage à l’échelle du génome soit réalisable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Ce protocole décrit les étapes pour générer un modèle 3D de la distribution des métabolites pendant l’infection par trypanosomatide, y compris la collecte d’échantillons, l’extraction de métabolites, un aperçu de l’acquisition de données de chromatographie de masse en tandem et de chromatographie liquide, la génération de modèles 3D et, enfin, la visualisation de données.

Approches de cartographie chimique pour étudier l’infection à trypanosomatidé

Pour faciliter la détection rapide et précise d’Acinetobacter baumannii, nous présentons un protocole qui utilise l’amplification par polymérase recombinase (RPA) en conjonction avec l’endonucléase LbaCas12a pour identifier les infections à A. baumannii .

Détection rapide et spécifique des infections à Acinetobacter baumannii à l’aide d’un système d’amplification par polymérase recombinase/système à base de Cas12a

Ici, nous décrivons une procédure simple et rapide pour détecter l’ADN d’agents pathogènes d’abeilles, tels que Lotmaria passim et Nosema ceranae, à l’aide d’une lyse cellulaire prête à l’amplification, d’une amplification par polymérase recombinase et de tests CRISPR/Cas12a.

Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Découvrez un protocole de gélification pour produire des réactions qPCR prêtes à l'emploi dédiées à la détection de l'ADN de Trypanosoma cruzi. Cette méthode réduit le temps de préparation et minimise les erreurs opérateur.

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

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