Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

La glande mammaire est très dynamique et subit de multiples cycles de remodelage tout au long de la vie. Notre protocole permet de capturer la dynamique cellulaire à l’origine des réarrangements tissulaires dans la glande mammaire saine et malade. Notre fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable permet d’effectuer une imagerie intravitale longitudinale de la glande mammaire sur de longues périodes, jusqu’à plusieurs semaines.

Le couvercle remplaçable de la fenêtre d’imagerie mammaire assure des conditions d’imagerie optimales à tout moment et permet la manipulation des tissus ou l’administration de médicaments entre les séances d’imagerie. Notre méthode fournit non seulement des informations sur la biologie de la glande mammaire saine, mais nous permet également d’étudier l’initiation et la progression de la tumeur mammaire au niveau de la cellule unique. Commencez par placer le couvercle de la fenêtre d’imagerie mammaire sur une surface stérile et appliquez de la colle adhésive cyanoacrylate sur tout le périmètre du couvercle du bord.

Placez soigneusement un couvercle en verre rond de 10 millimètres sur le couvercle. Utilisez un bâton en bois stérile pour positionner le couvercle en verre et appliquez une certaine force pour le pousser vers le bas afin d’assurer une étanchéité à l’air entre le couvercle en verre et le cadre du couvercle. Assurez-vous que le verre ne couvre pas les trous dans les bras du couvercle.

Désinfectez les couvercles et la fenêtre d’imagerie mammaire en les immergeant dans de l’éthanol à 80% pendant au moins 30 minutes dans une boîte de Pétri fermée. Utilisez une pointe de coton imbibée d’acétone pour enlever l’excès de colle adhésive cyanoacrylate sur le couvercle en verre. Pour préparer la souris à la chirurgie, rasez la zone autour de la quatrième glande mammaire à l’aide d’une lame de rasoir.

Utilisez le quatrième mamelon comme point de repère et retirez les poils lâches à l’aide de ruban adhésif. Effectuez un test de retrait de la patte pour vérifier si l’animal est correctement anesthésié. Soulevez doucement la peau à l’aide de pinces Graefe fines et utilisez de petits ciseaux à ressort pour faire une incision diagonale de 10 à 15 millimètres dans la peau sur le dessus du quatrième coussinet adipeux mammaire Utilisez le quatrième mamelon comme point d’orientation et assurez-vous de ne pas couper ou endommager le péritoine ou la glande mammaire.

Séparez la peau du coussinet adipeux mammaire et des couches tissulaires sous-jacentes à l’aide d’une dissection émoussée allant jusqu’à cinq à huit millimètres tout autour de la ligne d’incision pour créer une poche adaptée au cadre de la fenêtre d’imagerie mammaire. Définissez la région d’intérêt, ou ROI, en fonction des caractéristiques macroscopiques du tissu mammaire, y compris l’emplacement du ganglion lymphatique ou d’une lésion tumorale. Essayez de garder le retour sur investissement central en ce qui concerne l’incision.

Prenez la fenêtre d’imagerie mammaire à l’aide de pinces stériles et vérifiez si l’incision est assez grande pour insérer la fenêtre. Si nécessaire, agrandissez légèrement l’incision jusqu’à ce que la fenêtre d’imagerie mammaire s’insère. Retirez la fenêtre et utilisez une suture de soie 5-0 pour placer une suture de cordon de bourse à un à deux millimètres du bord de l’incision en commençant par l’extrémité caudale et de l’extérieur vers l’intérieur de la peau.

Déplacez-vous d’environ cinq millimètres vers le haut le long de l’incision et passez le fil de suture à travers la peau de l’intérieur vers l’extérieur. Répétez cette procédure le long du bord de l’incision, créant ainsi une suture circulaire composée de cinq à six boucles. La sortie finale du fil de suture doit être située à environ deux à cinq millimètres de la première entrée.

Placez la fenêtre d’imagerie mammaire à l’intérieur de l’incision et utilisez la pince Graefe pour placer soigneusement la peau dans la rainure de la fenêtre. Assurez-vous de laisser les boucles de la suture à l’extérieur. Tirez les boucles de la suture du cordon de la bourse et tirez doucement les deux extrémités de la suture pour la resserrer dans la rainure de la fenêtre d’imagerie mammaire.

Attachez-vous avec des nœuds chirurgicaux et coupez l’excès de fil. Utilisez un cure-dent pour appliquer de la vaseline sur le bord intérieur de la fenêtre, en évitant le tissu sous-jacent. Poussez doucement le cadre de la fenêtre vers le bas avec des pinces stériles et positionnez le couvercle dans le cadre de la fenêtre.

Cela évitera un volume d’air entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle de la fenêtre d’imagerie mammaire. Placez les extrémités des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et serrez le couvercle en le tordant dans le sens des aiguilles d’une montre. S’il reste un peu d’air après avoir resserré la paupière, introduisez une aiguille d’insuline stérile à travers la peau dans la cavité entre le tissu mammaire et la paupière et retirez lentement le piston, créant ainsi un vide entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle de la fenêtre d’imagerie mammaire.

Maintenant, le ganglion lymphatique peut être facilement observé après cette procédure. Inspectez l’état du cadre de la fenêtre d’imagerie mammaire et du couvercle, y compris la stabilité des sutures ou tout dommage potentiel au couvercle. Positionnez la souris sur l’incrustation de manière à ce que la fenêtre d’imagerie mammaire tombe dans le trou de l’incrustation de la boîte d’imagerie.

Appliquez du ruban semi-transparent et du ruban adhésif en papier sur le dos de la souris pour stabiliser la souris et réduire le mouvement des tissus dû à la respiration. Pour les séances d’imagerie de plus de trois heures, placez une aiguille flexible par voie sous-cutanée dans le cou de la souris et fixez-la avec du ruban adhésif en papier. Fixez une seringue de 10 millimètres avec un mélange de nutriments à un tube en silicone flexible et poussez le mélange de nutriments jusqu’à ce qu’il atteigne l’extrémité du tube.

Connectez le tube de silicone à l’aiguille flexible et injectez 50 microlitres de la solution infusée toutes les 30 minutes. Placez le couvercle sur la boîte d’imagerie pour la fermer. Ensuite, fixez la boîte d’imagerie dans la scène du microscope.

Vérifiez que la souris est stable à l’intérieur de la boîte d’imagerie. Définissez la zone d’intérêt à l’aide du mode d’épifluorescence du microscope et appliquez les paramètres du microscope. Utilisez la fonction Spirale en mode navigateur du logiciel d’imagerie pour générer un balayage de vignette de vue d’ensemble et créer une carte de référence du tissu.

Définissez la région d’intérêts dans la vue d’ensemble de la spirale, puis définissez les plans Z supérieur et inférieur pour déterminer la pile Z. Appuyez sur Démarrer pour obtenir les piles Z tridimensionnelles ou quadridimensionnelles détaillées du tissu. Placez les extrémités des pinces minces à travers les trous de fenêtre d’imagerie mammaires dans les bras du couvercle et desserrez le couvercle en le tordant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Alternativement, le tissu peut être manipulé ou repositionné à l’aide de pinces contondantes stériles pour optimiser les conditions d’imagerie pour la région d’intérêt spécifique. Appliquez de la vaseline sur le bord intérieur de la fenêtre d’imagerie mammaire, en évitant le tissu sous-jacent. Poussez doucement le cadre de la fenêtre vers le bas avec des pinces stériles et positionnez le couvercle dans le cadre de la fenêtre.

Enfin, placez les pointes des pinces minces à travers les trous des bras du couvercle et allégez le couvercle en le tordant dans le sens des aiguilles d’une montre. Des souris Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membrane tomate-membrane GFP ont été injectées avec une faible dose de tamoxifène, conduisant à une recombinaison médiée par Cre de l’allèle GFP à membrane tomate à membrane Rosa26. Les souris ont été photographiées les jours un, trois et cinq pour suivre les changements dynamiques dans la glande mammaire en développement.

Les images représentatives montrent le rendu 3D d’un conduit mammaire allongé et ramifié sur plusieurs jours imagé à travers une fenêtre d’imagerie mammaire. Des images uniques du plan Z de la pointe ramifiée et de la branche allongée sont montrées ici. Les cellules individuelles du stroma sont mises en évidence par des astérisques blancs.

Les images représentatives montrent le ganglion lymphatique inguinal de la souris imagé à travers une fenêtre d’imagerie mammaire. La deuxième génération harmonique est représentée en vert. Des images rendues en 3D d’une structure canalaire mammaire d’une souris CFP à membrane E-cadhérine femelle adulte sur plusieurs jours consécutifs sont montrées ici.

Le motif de collagène I a été utilisé pour retracer le même retour sur investissement et le signal CFP de la membrane E-cadhérine a été utilisé pour marquer les cellules canalaires. Les souris vert-rouge Kikume ont été photographiées au jour zéro avant et après l’exposition à la lumière violette. Les séances d’imagerie ont été répétées les deuxième, sixième et 10 jours suivant la conversion.

La même zone de la glande mammaire a été imagée à travers une fenêtre d’imagerie mammaire pendant 10 jours. Des régions plus petites ont été photo-converties le jour zéro et ont montré un taux de dilution similaire du signal rouge Kikume au fil du temps, indiquant un taux de renouvellement égal dans tout l’épithélium. Les images zoom des régions indiquées montrent une hétérogénéité proliférative au niveau cellulaire six et 10 jours après la photo-conversion.

La quantification du rapport rouge/vert de différentes cellules 10 jours après la photo-conversion a révélé des taux de dilution très variables de certaines cellules dans le même microenvironnement canalaire. Une étape cruciale de cette procédure consiste à ouvrir le couvercle entre les séances d’imagerie. Cette caractéristique unique de la fenêtre améliore les conditions d’imagerie et permet l’imagerie longitudinale du tissu.

La fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable facilitera de nouvelles questions concernant les tests de dépistage de médicaments in vivo à action rapide et le dépistage dans le domaine de l’initiation et de la progression de la tumeur dans la glande mammaire de la souris.