Mesure des propriétés du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de la microscopie à éclairage structuré en 3D (3D-SIM)
11 février 2022
Le présent protocole décrit une méthode pour visualiser et mesurer les anneaux d’actine et d’autres composants du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de neurones hippocampiques de rat cultivés et d’une microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM).
Ce protocole permet de résoudre le squelette périodique de la membrane dans le segment initial axonal des neurones cultivés. En examinant la localisation des protéines, il est possible d’obtenir des informations sur la fonction du squelette périodique de la membrane. Le principal avantage de cette technique est sa robustesse et sa facilité d’utilisation.
La microscopie à éclairage structuré est capable de résoudre le squelette périodique de la membrane et la préparation de l’échantillon est facile et directe. Toute personne ayant une expérience antérieure en microscopie à fluorescence peut facilement mettre en œuvre cette technique. Ce protocole est conçu pour maximiser le rapport signal/bruit lors de la préparation et de l’imagerie des échantillons.
Pour commencer, fixez les neurones en utilisant 4% de paraformaldéhyde pendant 12 minutes à température ambiante. Laver le couvercle une fois dans une solution tampon de phosphate à 0,2% BSA et incuber pendant 10 minutes dans une solution à 1% de Triton X dans PBS à température ambiante. Laver le couvercle avec du BSA dans une solution tampon de phosphate, diluer les anticorps anti-ankyrine G à l’aide de BSA dans une solution tampon de phosphate à un rapport de un à 200.
Ajouter la solution d’anticorps au couvercle et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate de BSA une fois dans 0,1% triton X dans une solution tampon de phosphate et une fois dans une solution tampon de phosphate. Diluer Fluoro 4 marqué, ajouter plus d’anticorps secondaires dans la solution tampon de phosphate BSA et ajouter au bordereau de couverture.
Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate BSA une fois dans 0,1% Triton X dans une solution tampon de phosphate, puis une fois dans une solution tampon de phosphate. Préparez une solution micromolaire de ferodine marquée dans une solution tampon de phosphate et ajoutez-la aux cellules. Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate d’albumine sérique bovine une fois dans 0,1% triton X dans une solution tampon de phosphate, puis une fois dans une solution tampon de phosphate.
Pour monter le couvercle sur une glissière en verre, appliquez une goutte de support de montage sur une glissière, trempez le couvercle dans de l’eau désionisée et tapotez-le avec une serviette en papier souple pour éliminer l’excès d’eau. Placez le couvercle sur la lame de verre et incubez à température ambiante pendant 24 heures. Si possible, consultez le personnel de l’installation de microscopie avant l’imagerie et utilisez un calculateur d’huile d’immersion pour sélectionner l’huile d’immersion appropriée pour l’échantillon.
Une fois les échantillons prêts, assurez-vous que les couvercles sont propres et exempts de tout résidu en les nettoyant avec une pointe de coton trempée dans de l’eau ou de l’éthanol. Placez l’échantillon dans un microscope 3D-SIM et trouvez la cellule pour capturer l’image. Ajustez la puissance des lignes laser concernées.
Et les temps d’exposition pour maximiser le rapport signal / bruit sans blanchir de manière significative l’échantillon. Définissez les limites supérieure et inférieure de l’échantillon dans la dimension Z et procédez à l’acquisition d’une pile. Exécutez l’algorithme de reconstruction sur la pile pour obtenir une reconstruction super résolue.
Vérifiez les reconstructions pour les artefacts connus et, si nécessaire, ajustez les paramètres pour les corriger. Comparez la reconstruction de la carte SIM à une image grand champ pour observer des améliorations de résolution. Lorsque vous effectuez une microscopie à éclairage structuré multicolore, utilisez l’algorithme d’alignement pour aligner correctement les différents canaux, une fois qu’une reconstruction satisfaisante est prête.
Les anneaux d’actine dans le squelette périodique de la membrane ont un aspect périodique distinctif. Créez une image de projection d’intensité maximale dans un logiciel d’analyse d’images en utilisant tous les plans focaux où les anneaux d’actine sont visibles. Sur l’image de projection d’intensité maximale, tracez une ligne perpendiculaire à travers les anneaux adjacents visibles et enregistrez l’intensité de fluorescence ainsi que la fonction de profil de tracé de ligne du logiciel.
Pour calculer la distance moyenne entre les pics, notez les maxima locaux dans le profil de ligne et mesurez la distance entre les pics d’intensité fluorescente adjacents individuels. Pour évaluer la colocalisation de différentes protéines avec des anneaux d’actine dans le squelette périodique de la membrane, exécutez une procédure d’analyse de colocalisation sur les reconstructions SIM de l’actine et de la protéine candidate. Dessinez manuellement une sélection pour définir le segment initial de l’axone comme une région d’intérêt, pour le plugin de colocalisation facile dans la plate-forme logicielle, et exécutez l’analyse pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson pour la colocalisation.
Au cours de l’analyse d’images SIM, les reconstructions de piles d’images ont montré une périodicité claire des anneaux d’actine. Un anticorps anti-ankyrine G a été utilisé pour visualiser l’ankyrine G.La colocalisation des anneaux d’ankyrine G et d’actine a été testée dans le segment initial de l’axone à l’aide d’une procédure d’analyse de colocalisation pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson. Le coefficient de corrélation de Pearson pour la colocalisation de la fluorescence de l’ankyrine G et des anneaux d’actine était de 0,36 plus ou moins 0,03.
Il est essentiel d’utiliser la bonne huile d’immersion et d’ajuster la puissance laser et le temps d’exposition pour rendre les lignes de la grille visibles. Une fois qu’il est déterminé que la protéine fait partie du squelette périodique de la membrane, sa fonction peut être étudiée et établie dans le maintien du squelette périodique de la membrane. Par exemple, les effets de l’élimination de la protéine sur les anneaux d’actine peuvent être analysés.
Le développement de techniques de microscopie à super résolution est la raison pour laquelle nous savons que le segment initial de l’axone contient un squelette périodique membranaire composé d’anneaux d’actine, de spectre et d’ankyrine. SIM a permis aux chercheurs de visualiser facilement les composants périodiques du squelette membranaire et d’examiner les anneaux d’actine dans les cellules vivantes.
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Aperçu
Cette étude décrit un protocole pour visualiser et mesurer les anneaux d'actine au sein du squelette périodique de la membrane du segment initial de l'axone en utilisant des neurones hippocampiques de rat cultivés et la microscopie à illumination structurée 3D (3D-SIM). Cette technique permet aux chercheurs d'explorer la localisation des protéines, améliorant la compréhension de la fonction du squelette périodique de la membrane.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Technique de microscopie
Contexte
- Le segment initial de l'axone est crucial pour la signalisation neuronale.
- Les anneaux d'actine jouent un rôle important dans le maintien du squelette périodique de la membrane.
- La microscopie à illumination structurée améliore la résolution dans l'imagerie d'échantillons biologiques.
- La compréhension de la localisation des protéines offre des aperçus sur leurs rôles fonctionnels.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour l'imagerie des anneaux d'actine dans les neurones cultivés.
- Élucider les composants du squelette périodique de la membrane.
- Faciliter l'analyse de colocalisation de diverses protéines dans le segment initial de l'axone.
Méthodes utilisées
- Utilisation de la microscopie à illumination structurée 3D pour l'imagerie.
- Le modèle biologique clé impliquait des neurones hippocampiques de rat cultivés.
- Aucune mention des flux de travail multiomiques n'a été trouvée dans le texte.
- Les étapes critiques comprenaient la fixation, l'incubation des anticorps et la préparation de l'imagerie.
- Une analyse d'image a été réalisée pour évaluer la périodicité des anneaux d'actine et la colocalisation des protéines.
Résultats principaux
- Le protocole a permis la visualisation des anneaux d'actine avec une périodicité distinctive.
- La colocalisation de l'ankyrine G et des anneaux d'actine a été quantifiée, donnant un coefficient de Pearson de 0,36 ± 0,03.
- L'identification des anneaux d'actine soutient leur rôle dans le squelette périodique de la membrane.
- La SIM a permis des améliorations de résolution claires par rapport aux méthodes d'imagerie à champ large traditionnelles.
Conclusions
- L'étude démontre une méthode robuste pour analyser le squelette périodique de la membrane dans les neurones.
- Les techniques d'imagerie améliorées contribuent à la compréhension de l'architecture cellulaire dans les cellules neuronales.
- Les aperçus de cette recherche posent les bases de l'exploration future des fonctions des protéines neuronales et de leurs implications en santé et en maladie.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
