Utilisation de la microscopie à 2 photons pour quantifier les effets de l’obstruction urétérale unilatérale chronique sur les processus glomérulaires

Dans les données présentées dans cette étude montrent les effets dramatiques de l’obstruction urétérale unilatérale sur la fonction rénale, l’inflammation et la fibrose. Il nous aide à comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’obstruction urétérale unilatérale. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’étudier les interactions cellule-cellule, les événements subcellulaires et d’associer la structure et la fonction de manière dynamique au sein d’un rein fonctionnel.

La démonstration de la procédure urétérale sera effectuée par le Dr Silvia Campos-Bilderback, chirurgien dans notre laboratoire. Pour commencer, anesthésiez le rat, puis faites une incision le long de la ligne médiane et localisez le rein gauche pour le séparer des organes péritonéaux environnants. Après avoir localisé le pédicule rénal, comprenant l’artère rénale, la veine rénale et l’uretère, séparez l’uretère sans endommager la structure délicate.

Utilisez une pince pour boucler et attacher une suture 3-0 autour de l’uretère, puis nouez un nœud de quelques millimètres de chaque côté du premier nœud pour assurer une obstruction complète. Une fois l’uretère attaché, fermez soigneusement les couches musculaires successives, puis fermez complètement l’abdomen. Fermez la peau externe avec des agrafes chirurgicales.

Pour la préparation chirurgicale, placer le rat anesthésié avec une ligne d’accès veineux à demeure sur le côté avec le flanc gauche rasé vers le haut et droit sur la table. Assurez-vous que les pattes avant du rat se touchent, tout comme les pattes arrière. Une fois que le rat est positionné, palper le flanc gauche juste en dessous des côtes pour palper le rein et déterminer la position naturelle dans l’abdomen, puis tracez une ligne à l’aide d’un marqueur permanent le long de la zone rasée, en divisant le centre du rein dans une orientation nez à queue.

Utilisez une paire de pinces dentées pour saisir et soulever la peau vers le haut et pincez la ligne de marquage permanent avec une paire d’hémostatiques pour écraser le système vasculaire sous-jacent et prévenir les saignements. Répétez la procédure pour la fine couche musculaire externe afin de minimiser les saignements. Pour faire l’incision finale de la fine couche musculaire abdominale interne, palper le rein pour estimer la taille et la position et soulever la couche musculaire interne avec une paire de forceps, puis écraser une ligne qui coupe la peau au-dessus du rein avec les hémostatiques qui est environ 1/3 de la taille estimée du rein.

Tout en maintenant la prise sur la couche musculaire avec la pince, faites l’incision finale. Ensuite, utilisez une pince dans chaque main pour saisir et maintenir la graisse rénale au pôle inférieur du rein avec une technique main sur main travaillant vers le bas. Ayant une prise ferme sur la graisse d’une main, tirez la graisse et pressez très doucement le rein à travers l’incision.

Si le rein ne passe pas à travers, élargissez facilement l’incision. Pour identifier les globules blancs ou les globules blancs logés dans les anses capillaires, administrer la coloration nucléaire Hoechst 33342 à 8 microgrammes par kilogramme de poids de rat via une ligne d’accès veineux à demeure. Au microscope, placez le rein exposé contre le bord de la capsule avec une légère rotation de sorte que le côté abdominal du rein entre en contact avec la glissière de couverture et que le côté dorsal soit tourné vers l’extérieur du bord.

Pour minimiser davantage les mouvements, emportez deux compresses de gaze stériles 2 par 2 humidifiées avec une solution saline contre la face dorsale du rein, renforçant ainsi le contact de la face abdominale du rein avec le bord. Lorsque l’échantillon est positionné, regardez à travers l’oculaire du microscope sous éclairage d’épifluorescence à l’aide d’un cube FITC de rhodamine à double passage. Si un mouvement est détecté dans la position de l’échantillon, faites des ajustements mineurs en ajustant la gaze pour vous assurer qu’elle ne pousse pas sous le rein.

Rouler légèrement le rat pour que le thorax soit plus éloigné du plat. Balayez la surface du rein à l’aide de l’éclairage par épifluorescence et marquez les positions des glomérules à l’aide du logiciel associé au contrôleur de scène motorisé. Pour chaque canal de couleur sous éclairage à 2 photons, prenez un volume 3D peu profond de la partie supérieure de chaque glomérule marqué pour servir d’image d’arrière-plan.

Dans l’option d’affichage du logiciel d’imagerie, utilisez une pseudo-palette de couleurs pour visualiser les faibles intensités de la fluorescence de fond des boucles capillaires glomérulaires. En utilisant un vaisseau sanguin superficiel comme point focal, infuser lentement l’albumine sérique fluorescente Texas Red RAP ou TRRSA tout en observant la montée et la baisse de la fluorescence due à la distribution systémique jusqu’à ce qu’une intensité dans les boucles vasculaires péritubulaires et capillaires soit juste en dessous de la saturation. Après 10 minutes, acquérir des volumes 3D pour tous les glomérules marqués et imagés à des intervalles de 1 micromètre.

Trouvez un vaisseau approprié, soit une boucle capillaire ou un vaisseau péritubulaire, puis faites pivoter l’image à l’aide de la fonction Rotate, car la fonction Line Scan du logiciel d’acquisition d’images exige que le vaisseau soit perpendiculaire. Une fois le navire pivoté et couché à plat, sélectionnez la fonction XT dans le menu Acquisition et configurez-la pour balayer 4 000 lignes. Placer la ligne à travers le récipient à examiner avec le plan focal au diamètre maximal du segment.

Cliquez ensuite avec le bouton gauche de la souris sur l’image composite couleur et sélectionnez l’onglet Prendre un instantané pour générer une image de référence de la zone où le balayage au trait a été effectué. Cliquez immédiatement sur le bouton Démarrer pour capturer le balayage de la ligne du navire. Plus tard, importez les balayages de ligne dans le logiciel de traitement d’image pour déterminer le débit RBC.

Dans le menu déroulant Mesure, ouvrez la boîte de dialogue Afficher les statistiques de région et sélectionnez l’outil Dessin au trait unique pour tracer une ligne qui correspond à la pente des ombres RBC. Après avoir noté la largeur et la hauteur de la ligne, utilisez une équation pour calculer la vitesse, puis obtenez une moyenne de cinq calculs pour indiquer la vitesse de chaque balayage de ligne. Centrez un glomérule dans le champ d’imagerie et prenez un ensemble de données 3D commençant à la surface glomérulaire et se terminant à 30 à 35 micromètres.

Utilisez une taille de pas de 1 micromètre dans la direction Z. Identifier les globules blancs en comparant le canal bleu Hoechst avec le canal d’albumine Texas Red en recherchant l’exclusion du colorant rouge dans la boucle capillaire et une coloration nucléaire correspondante. Si les globules blancs apparaissent statiques sur trois sections optiques, définissez les cellules comme étant adhérentes, puis indiquez les valeurs comme occurrence par 10 sections optiques du haut du glomérule prélevées à des intervalles de 1 micromètre.

Le nombre de rats glomérulaires par champ chez les rats Wistar Fromter ou MWF de Munich a augmenté dans le groupe UUO de 5 semaines que chez les rats non traités. Les rats Sprague-Dawley, ou rats SD, sont passés de l’absence de glomérules de surface à 2,02 par champ après cinq semaines d’obstruction urétérale unilatérale. Des images reconstruites en trois dimensions ont été observées pour voir la surface rénale.

L’obstruction unilatérale de l’urétale pendant 5 semaines chez les rats SD n’a pas entraîné de zones ressemblant à des épithéliums tubulaires normaux comme on l’a vu chez les rats MWF UUO, non traités et partiellement chez les rats UUO MWF de 5 semaines. Dans l’étude de la dynamique vasculaire rénale, le débit sanguin rénal a été significativement réduit dans les groupes UUO MWF et SD de 5 semaines par rapport aux rats non traités. La vitesse des globules rouges dans les boucles capillaires glomérulaires a été significativement réduite chez les rats UUO MWF et SD de 5 semaines par rapport aux rats MWF non traités.

De plus, les rats MWF non traités avaient moins de globules blancs par 10 sections optiques à partir du sommet, tandis que le nombre augmentait chez les rats UUO MWF à 5 semaines et UUO SD à 5 semaines. Avec l’obstruction unilatérale de l’urétal, une augmentation de la perméabilité de l’albumine a été observée. Une accumulation d’albumine dans l’espace Bowman était intense après une obstruction unilatérale de l’urétal.

L’endocytose du segment S1 de grandes quantités d’albumine observées avec des conditions physiologiques chez des rats MWF non traités. La même absorption n’a pas pu être observée chez les rats MWF ou SD après 5 semaines d’obstruction unilatérale de l’urétal. De nombreuses méthodes différentes telles que l’imagerie répétée pour étudier un processus au fil du temps, la fixation d’une zone spécifique pour l’imagerie et l’utilisation ultérieure du tissu fixe pour effectuer une microscopie à plus haute résolution peuvent être effectuées en conjonction avec cette technique.

La technique est considérée comme une technologie perturbatrice. Il permet aux enquêteurs de répondre à de nombreuses nouvelles questions. Ce faisant, de nouvelles idées ont été fournies et des données sur le changement de paradigme ont été obtenues.