Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller
13 mai 2022
Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.
Il existe plusieurs méthodes pour mesurer la production de ROS, ou stress oxydatif dans les cellules. Parmi ceux-ci, la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine de 2'7'est l’une des techniques les plus largement utilisées pour mesurer directement l’état redox. Cette sonde est lipophile et non fluorescente. La diffusion de cette sonde à travers la membrane cellulaire permet aux estérases intracellulaires de cliver les deux liaisons ester, produisant un produit relativement polaire et imperméable à la membrane cellulaire. Ces molécules non fluorescentes s’accumulent intracellulairement, et l’oxydation subséquente par ROS donne le produit hautement fluorescent dichlorofluorescéine. L’oxydation de la sonde est le produit de l’action de plusieurs types de ROS. Qui peut être détecté par cytométrie en flux ou microscopie confocale. Dans cet article, nous avons utilisé une sonde de diacétate de dichlorofluorescéine pour mesurer et quantifier les ROS par cytométrie en flux. Transférer les plaques de 6 puits dans une hotte à flux laminaire à partir de l’incubateur. Aspirer le surnageant. Et lavez les cellules une fois avec PBS. Ajouter 2 mL de DMEM faible sérique par puits. Et incuber la plaque de 6 puits pendant deux heures dans l’incubateur. Traitez les cellules avec l’antioxydant pendant six heures. Traiter les cellules avec l’inducteur ROS, A ou B, pendant 30 minutes. Aspirer le surnageant. Et lavez la cellule trois fois avec PBS pour éliminer tous les stimuli. Éteignez la lumière de la hotte à flux laminaire et travaillez dans l’obscurité. Ajouter 1 mL de sonde de diacétate de dichlorofluorescéine dans le DMEM sans rouge de phénol. Ajouter 1 mL de DMEM sans rouge phénol aux cellules témoins de contrôle de l’autofluorescence. Incuber la plaque à 6 puits pendant 30 minutes dans l’incubateur. Transférer les plaques sur la glace au laboratoire. Lavez les cellules trois fois avec 2 mL de PBS froid par puits. Ajouter 0,5 mL de tampon de détachement à froid à chaque puits. Récoltez les cellules en piquant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000. Collectez-les dans un tube étiqueté de 1,5 mL. Et centrifugez-les à 600 x g pendant cinq minutes à 4 C.Jetez soigneusement le surnageant et dissociez doucement la pastille avec le taraudage. Ajouter 1 mL de tampon FACS pour laver les cellules de chaque tube étiqueté. Si nécessaire, utilisez le vortex dans la plus faible intensité pour la dissociation complète de la pastille. Centrifugez-les à 600 x g pendant cinq minutes à 4 C.Répétez cette étape deux fois plus. Trois lavages au total. Remettre en suspension des pastilles de cellules dans 200 L de tampon FACS. Dissocier complètement la pastille dans chaque tube en utilisant le vortex. Et transfert à 5 mL étiquetés pour les tubes de cytomètre en flux. Gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient analysés sur cytomètre en flux. À l’aide du logiciel de cytométrie en flux, créez une nouvelle expérience. Cliquez sur l’échantillon et ouvrira une liste de tubes. Double-cliquez dessus et renommez-les. Placez le tube de contrôle de l’autofluorescence sur le bras de l’aspirateur, en déplaçant soigneusement la base uniquement vers la gauche. Cliquez sur Acquérir des données, puis sur Enregistrer les données, puis sélectionnez la condition d’arrêt souhaitée. Dessinez une porte autour des cellules d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris. Retirez le tube. Cliquez sur Tube suivant et exécutez l’exemple de contrôle basal. Cliquez sur Acquérir des données, puis sur Enregistrer les données.Ouvrez le logiciel. Ajoutez les exemples à l’aide du bouton d’action Ajouter des exemples. Cliquez sur Ajouter un échantillon.Sélectionnez le dossier Date expérimentale et cliquez sur Choisir.Double-cliquez sur le premier exemple de votre espace de travail, contrôle d’autofluorescence dans ce cas. Dessinez une porte polygonale pour isoler la cellule d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris. Remplacez le tracé par un histogramme. Double-cliquez dans le M
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Aperçu
Cette étude présente un protocole pour la détection des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) cellulaires à l'aide de la sonde 2′,7′-dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). La méthode est conçue pour être accessible, reproductible et quantifier les ROS par cytométrie en flux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Stress oxydatif
- Neurosciences
Contexte général
- Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires.
- La mesure des ROS est essentielle pour comprendre le stress oxydatif dans les cellules.
- La sonde DCFH-DA est une méthode largement utilisée pour la détection des ROS.
- Le protocole met l'accent sur la reproductibilité et la facilité d'utilisation.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole clair pour la détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules gliales de Müller.
- Permettre la quantification du stress oxydatif dans les cellules neuronales.
- Faciliter la recherche sur le rôle des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la fonction gliale et la neurobiologie.
Méthodes utilisées
- Une culture cellulaire de cellules gliales de Müller a été réalisée afin de créer le modèle biologique.
- Les cellules ont été traitées avec des antioxydants et des inducteurs de ROS afin d'évaluer les niveaux de ROS.
- La sonde DCFH-DA a été utilisée pour la détection des ROS et quantifiée par cytométrie en flux.
- Les étapes critiques comprenaient le lavage des cellules avec du PBS et le contrôle de l'exposition à la lumière durant les tests.
Résultats principaux
- Le protocole a permis de mesurer efficacement les niveaux de ROS cellulaires dans les cellules gliales de Müller.
- La cytométrie en flux a fourni une analyse quantitative de l'accumulation de ROS.
- Les résultats ont confirmé la faisabilité d'utiliser la sonde DCFH-DA dans les conditions spécifiées.
Conclusions
- Cette étude établit une méthode fiable pour évaluer le stress oxydatif dans les cellules gliales.
- Le protocole simplifie la mesure des ERO, améliorant ainsi l'accessibilité pour les chercheurs.
- Les résultats ont des implications pour la compréhension du stress oxydatif en neurobiologie et pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mesure quantitative des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules gliales de Müller à l'aide du DCFH-DA et de la cytométrie en flux permet une évaluation solide des mécanismes de stress oxydatif liés aux modèles de maladies neurodégénératives et rétiniennes. Cette capacité soutient la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques liée à la modulation des voies antioxydantes. Une quantification fiable des ROS éclaire les décisions portant sur le portefeuille de molécules candidates ciblant l'homéostasie redox dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse de l'activation de la voie des antioxydants et de la modulation redox dans les modèles de cellules gliales.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles impliquées dans le stress oxydatif et les mécanismes de défense cellulaire.
- Offre une détection mécanistique des risques pour les interventions candidates affectant les niveaux de ROS.
Développement de criblages et de tests
- Facilite la préparation de systèmes cellulaires validés pour le criblage de composés ciblant les paramètres liés au stress oxydatif.
- Permet d'obtenir des mesures quantitatives normalisées des espèces réactives de l'oxygène, adaptées à la reproductibilité des tests et à la comparaison entre études.
- Permet une évaluation fiable des effets antioxydants ou pro-oxydants de composés dans un format évolutif.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour les pathologies rétiniennes impliquant le stress oxydatif, telles que la rétinopathie diabétique.
- Permet une continuité translationnelle en reliant la modulation des ERO in vitro aux stratégies précliniques de biomarqueurs.
- Éclaire l'avancement pondéré des candidats antioxydants selon des résultats cellulaires quantitatifs.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole de quantification des ERO s'inscrit dans la phase initiale de découverte menant à l'identification de candidats, en soutenant à la fois la vérification d'hypothèses et l'intégration dans des criblages ultérieurs.
- Biologie de la découverte : Fournit des preuves quantitatives de l'engagement des voies redox et de la réponse cellulaire aux agressions oxydatives.
- Tri de composés : Fournit des mesures reproductibles de ROS par cytométrie en flux pour le tri de composés.
- Analyse : Permet la comparaison statistique des niveaux de ROS entre différentes conditions expérimentales à l'aide de l'intensité de fluorescence moyenne géométrique.
- Recherche translationnelle : Relie la modulation du stress oxydatif in vitro à des paramètres pertinents pour la maladie dans des modèles rétiniens.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme normalisée de dosage des ERO, adaptable à divers types cellulaires et agents modulant le statut redox.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la découverte ciblant les réactions d'oxydoréduction et réduit l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Fournit une quantification normalisée, évolutible et reproductible des espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour des flux de travail interéquipes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon pour les modulateurs des voies antioxydantes et renforce l'efficacité du capital.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des candidats ciblant les mécanismes de stress oxydatif.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux, tant pour l'exploitation de l'appareil que pour l'analyse des données.
- Exige un accès à un équipement de cytométrie en flux et à un logiciel d'analyse compatible.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de sélection des populations cellulaires (gating) et de quantification de la fluorescence.
- Adaptable à d'autres modèles cellulaires moyennant une optimisation du protocole pour le chargement de la sonde et les contrôles.
- Dépend d'une manipulation rigoureuse des échantillons afin de minimiser la variabilité de l'essai et les artefacts induits par la lumière.
