Administration de médicaments par pompe osmotique pour la recherche sur la remyélinisation in vivo sur le système nerveux central

La démyélinisation a lieu dans de multiples maladies du système nerveux central. Une technique fiable d’administration de médicaments in vivo est nécessaire pour remyéliniser les tests de dépistage de médicaments. Ce protocole décrit une méthode osmotique à base de pompe qui permet l’administration de médicaments à long terme directement dans le parenchyme cérébral et améliore la biodisponibilité du médicament, avec une large application dans la recherche sur la remyélinisation.

La pompe osmotique est d’une grande valeur pour la recherche sur la régénération de la myéline, en particulier pour les médicaments ayant une demi-vie courte, une faible perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et divers effets secondaires périphériques. La pompe osmotique peut contourner la barrière hémato-encéphalique et administrer des médicaments directement au corps calleux, ce qui améliore efficacement la biodisponibilité des médicaments, en particulier pour certains médicaments à courte demi-vie. Pour commencer, fixez la tête d’une souris anesthésiée dans l’appareil stéréotaxique avec une barre dentaire et des barres d’oreille.

Couvrir le corps de l’animal à l’exception du site chirurgical. À l’aide d’un scalpel, faites une incision mi-sacertale d’un centimètre de long de la peau de la base du cou à l’intérieur des yeux pour exposer le crâne. À l’aide d’un coton-tige contenant 30% de peroxyde d’hydrogène, essuyez doucement la surface du crâne pour visualiser les structures crâniennes.

Ajustez la hauteur de la barre dentaire et des barres auriculaires pour placer le point lambda et le point bregma à la même hauteur. Placez doucement l’extrémité d’une aiguille de seringue de calibre 10 microlitres et 33 au point bregma et réinitialisez les coordonnées X, Y et Z à zéro. Déplacez la seringue vers le site d’injection.

Percez lentement un petit trou de bavure à travers le crâne au site d’injection sans pénétrer dans la dure-mère avec une aiguille de seringue de calibre 26 d’un microlitre et de 0,45 millimètre. Insérez lentement l’aiguille de la seringue en microlitre dans le tissu cérébral à travers le trou jusqu’à ce qu’une certaine profondeur soit atteinte. Injecter 1,5 microlitre de 1% de lysolécithine à une vitesse de 0,5 microlitre par minute.

Attendez cinq minutes avant de retirer la seringue et cousez la peau avec 5-0 sutures chirurgicales. Placez la souris qui a subi une intervention chirurgicale seule dans une cage et surveillez la souris quotidiennement après l’opération. Fixez trois entretoises de réglage de la profondeur à l’aiguille de la canule de perfusion cérébrale avec un adhésif tissulaire pour obtenir une profondeur d’injection de 1,5 millimètre proche du callosité.

Remplissez la pompe osmotique en attachant l’aiguille de la seringue avec un emballage de pompe à une seringue d’un millilitre et aspirez le médicament. Maintenez la pompe en position verticale. Insérez la seringue dans l’ouverture en haut de la pompe et injectez lentement le médicament sans créer de bulle d’air.

Retirez lentement la seringue lorsque le liquide s’écoule de l’ouverture. À l’aide de ciseaux ou de pinces, retirez la bride blanche du régulateur de débit. Insérez le modérateur de débit dans la pompe.

Pour déterminer s’il y a des bulles dans la pompe osmotique, pesez la pompe osmotique séparément, avant et après le remplissage. Coupez le cathéter à la longueur requise en fonction de la taille de l’animal. Fixez le cathéter à la canule de perfusion cérébrale.

Remplissez le cathéter avec des médicaments à l’aide de la seringue sans introduire d’air. Connectez le cathéter au modérateur de débit afin qu’il couvre environ quatre millimètres du modérateur de flux exposé. Immerger les pompes remplies dans une solution saline stérile à 0,9 % ou PBS à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre à six heures.

Préférez prolonger du jour au lendemain après la mise en œuvre. Fixez à nouveau les souris sur l’appareil stéréotaxique. Ouvrez l’incision chirurgicale précédemment cousue et étendez l’incision jusqu’aux omoplates.

Séparez la peau du tissu conjonctif sous-cutané au niveau de l’omoplate, à l’aide d’une pince hémostatique ou d’une pince à épiler pour ouvrir une cavité, et placez la pompe osmotique dans la cavité. À l’aide d’un coton-tige, essuyez doucement et exposez le trou d’épingle à la surface du crâne créé lors de l’établissement du modèle de démyélinisation. Insérez la canule de perfusion cérébrale à travers le sténopé perpendiculairement et fixez-la sur le crâne avec de l’adhésif tissulaire.

Enlevez la languette amovible au-dessus de la canule de perfusion cérébrale avec une paire de ciseaux. Coudre l’incision ou l’attacher avec de l’adhésif tissulaire. Placez l’animal dans une cage seul après la chirurgie.

Après avoir effectué la mise en œuvre, la coloration DAPI a révélé que le sténopé dans le tissu cérébral se trouve juste au-dessus de la substance blanche, indiquant une mise en œuvre réussie de la canule de perfusion cérébrale de la pompe osmotique. L’expérience d’hybridation in situ a été réalisée avec une sonde MAG marqueur oligodendrocyte mature qui a été utilisée pour marquer les oligodendrocytes nouvellement différenciés. Les résultats ont montré que le traitement UM206 a donné plus de cellules MAG positives dans la région démyélinisée que le groupe témoin.

La microscopie électronique à transmission de la région démyélinisée a montré que le nombre d’axones myélinisés était augmenté dans le groupe de traitement UM206 par rapport au groupe témoin, ce qui suggère que UM206 induisait un niveau plus élevé de remyélinisation. Lors de la préparation de la pompe osmotique, veillez à ne pas introduire de bulle dans le système.