Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris

Ce protocole fournit des lignes directrices étape par étape pour une voie d’accès reproductible aux régions d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Cette technique augmente la précision lors de l’administration de petits volumes d’injection à des régions restreintes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Cette technique a été et peut être appliquée à d’autres modèles animaux.

La Dre Veronique VanderHorst, professeure agrégée de neurologie et chercheuse principale du laboratoire VanderHorst, fera la démonstration de cette procédure. Assurez-vous que le flux d’oxygène est dirigé vers le cône du nez. Déplacez la souris sur le cadre stéréotaxique et placez le nez dans un cône de nez flexible.

Placez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille uniquement. Placez du lubrifiant sur les yeux. Antéroflex la tête de la souris à un angle de 90 degrés en guidant manuellement le nez.

Pour sécuriser cette position, placez une barrière en plastique entre les piliers de la barre d’oreille de l’adaptateur de souris parallèlement aux piliers avec la partie plate du crâne servant de référence. Placez le coussin chauffant sous la souris et assurez-vous que le cou et le reste du corps sont positionnés parallèlement à la table en élevant le corps avec une petite boîte. Placez un drapé sous le corps.

Injecter une dose unique de quatre milligrammes par kilogramme de Méloxicam à libération lente par voie sous-cutanée à un volume de deux microlitres par gramme de poids corporel. Nettoyez d’abord le site d’incision chirurgicale avec un tampon de préparation à 70% d’alcool, puis avec un tampon de préparation à la bétaïne, puis à nouveau avec un tampon de préparation à l’alcool et laissez-le sécher. Désinfectez les mains et mettez des gants stériles, puis placez un drapé sur le site chirurgical.

Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pinçant les orteils ou en vérifiant le réflexe cornéen. Réduire l’isoflurane pour maintenir les niveaux à 2,0. Faites une incision d’un à 1,2 centimètre avec une lame chirurgicale de 10 du bord de l’os occipital vers les épaules en un seul mouvement lisse.

Faites soigneusement une incision dans le raphé médian du muscle trapèze, exposant les muscles longus capitis appariés. Placez les deux crochets d’enrouleur entre les muscles appariés de longus capitis, l’un orienté vers la gauche et l’autre vers la droite. Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les ventres gauche et droit du muscle longus capitis apparié, en commençant par l’occiput où la ligne médiane est facilement visible.

Guidez la pince émoussée à travers l’os de l’occiput dans la ligne médiane jusqu’à l’endroit où elle rencontre la dure-mère cisternale, puis continuez à travers la dure-mère jusqu’à l’atlas. Repositionnez les rétracteurs et ajustez la tension en repositionnant les hémostats. Utilisez les pinces à laminectomie contondantes pour séparer davantage les muscles dans la ligne médiane afin d’obtenir une bonne vue du tronc cérébral et du cervelet.

Répétez la procédure ci-dessus au besoin jusqu’à ce que le cervelet et le tronc cérébral apparaissent sous la dure-mère. À l’aide de pinces à laminectomie contondantes, dégagez la dure-mère des petits brins de tissu conjonctif en déplaçant la pince de la ligne médiane dans une direction latérale jusqu’à ce qu’il y ait une vue claire du tronc cérébral, créant ainsi plus d’espace latéral. Visualisez la surface dorsale du tronc cérébral avec des repères détaillés à travers la dure-mère ouverte.

Utilisez la pince inclinée pour saisir la dure-mère s’étendant de l’os occipital à l’atlas, puis utilisez les ciseaux à ressort pour faire une petite ouverture d’environ 0,5 à 1,5 millimètre dans la dure-mère. Une fois la dure-mère ouverte, drainez l’excès de liquide céphalo-rachidien avec un Q-tip stérile. L’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le quatrième ventricule, est le point zéro standard antérieur-postérieur et médiolatéral.

Placez la pipette ou la seringue sur la cible à l’aide du bras stéréotaxique. Abaissez le bras de la dorsale sur la surface dorsale qui se forme à partir du point zéro dorsoventral. Ensuite, abaissez la pipette sur le tronc cérébral et injectez la solution.

Laissez l’aiguille en place pendant une à cinq minutes après l’injection pour éviter une trace d’aiguille lorsque vous utilisez des volumes compris entre trois et 50 nanolitres. Soulevez ensuite la pipette ou la seringue à l’aide du bras stéréotaxique et répétez cette opération pour plusieurs cibles. Retirez soigneusement les crochets du champ chirurgical.

Les muscles de longus capitis appariés retomberont dans une position neutre couvrant entièrement la cisterna magna. Ne fermez pas le muscle trapèze et la dure-mère dans la ligne médiane car ils sont trop fragiles pour tenir les sutures. Fermez la peau avec 3 sutures en nylon ou en polypropylène.

L’approche cisterna magna permet de cibler le tronc cérébral caudal et les structures de la moelle cervicale supérieure qui sont autrement difficiles à atteindre par des approches stéréotaxiques standard ou qui sont sujettes à un ciblage incohérent. Chez la souris, des structures telles que le noyau hypoglosse, le groupe respiratoire ventral et la formation réticulaire adjacente dans le tronc cérébral caudal ont été systématiquement ciblées à l’aide de l’approche cisterna magna comme illustré ici pour le noyau hypoglosse et la médulla ventromédiale. Afin de déterminer la précision de l’approche cisterna magna par rapport à l’approche standard, la distance entre les sites cibles prévus et réels dans les plans antéropostérieur, médiolatéral et dorsoventral pour les régions ventrale et dorsale a été mesurée.

Les résultats montrent des erreurs significativement plus faibles dans les plans antéropostérieur, médiolatéral et dorsoventral par rapport à l’approche standard, ce qui souligne la précision accrue de l’approche cisterna magna pour ces cibles. Lors de la tentative de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que l’antéroflexion de la tête et l’élévation du corps sont effectuées comme décrit. Ensuite, il est important de reconnaître les points de repère clés avant de manipuler le muscle ou la dure-mère.

Si ces repères ne sont pas reconnus ou s’ils sont perdus, il sera difficile de rester orienté et d’exécuter la procédure comme prévu. Cette technique a permis de répondre à des questions conceptuelles liées à l’organisation anatomique fonctionnelle dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure.