Name: Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez l'analyse du flux extracellulaire Seahorse pour étudier le métabolisme mitochondrial des sphéroïdes 3D en recherche cancéreuse. Cette méthode offre un modèle physiologique supérieur aux cultures monocouches.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Principales constatations et extrants Cet article fournit un protocole détaillé pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide d’une série de lignées cellulaires dérivées du cancer avec l’analyseur XFe96 XF. Une méthode est développée et décrite pour la culture rapide des sphéroïdes cellulaires A549, HepG2/C3A, MCF7 et SK-OV-3 en utilisant des technologies d’hydrofuge cellulaire pour l’agrégation forcée. Ce protocole aborde de nombreuses considérations relatives...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Les progrès des modèles in vitro dans la recherche biologique ont progressé rapidement au cours des 20 dernières années. Ces modèles incluent désormais des modalités d’organe sur puce, des organoïdes et des sphéroïdes de microtissus 3D, qui sont tous devenus un objectif commun pour améliorer la traduction entre les études in vitro et in vivo. L’utilisation de modèles in vitro avancés, en particulier les sphéroïdes, couvre plusieurs domaines de recherche, notamment l’ingénierie tissulaire, la recherche sur les cellules souches, le cancer et la biologie des maladies 1,2,3,4,5,6,7, et les tests de sécurité, y compris la toxicologie génétique 8,9,10, la toxicologie des nanomatériaux 11, 12,13,14, et tests d’innocuité et d’efficacité des médicaments 8,15,16,17,18,19.
La morphologie cellulaire normale est essentielle au phénotype et à l’activité biologiques. Cultiver des cellules en sphéroïdes de microtissus 3D permet aux cellules d’adopter une morphologie, une fonction phénotypique et une architecture, plus proches de celles observées in vivo mais difficiles à capturer avec les techniques classiques de culture cellulaire monocouche. Tant in vivo qu’in vitro, la fonction cellulaire est directement affectée par le microenvironnement cellulaire, qui ne se limite pas à la communication et à la programmation cellulaires (p. ex., formations de jonctions cellule-cellule, possibilités de former des niches cellulaires); l’exposition cellulaire aux hormones et aux facteurs de croissance dans les environnements immédiats (p. ex., exposition aux cytokines cellulaires dans le cadre d’une réponse inflammatoire); la composition des matrices physiques et chimiques (p. ex., si les cellules sont cultivées dans un plastique de culture tissulaire rigide ou dans un environnement tissulaire élastique); et surtout, comment le métabolisme cellulaire est affecté par la nutrition et l’accès à l’oxygène ainsi que par le traitement des déchets métaboliques tels que l’acide lactique.
L’analyse du flux métabolique est un moyen puissant d’examiner le métabolisme cellulaire dans des systèmes in vitro définis. Plus précisément, la technologie XF permet d’analyser les changements en direct et en temps réel dans la bioénergétique cellulaire des cellules et des tissus intacts. Étant donné que de nombreux événements métaboliques intracellulaires se produisent dans l’ordre de quelques secondes à quelques minutes, les approches fonctionnelles en temps réel sont primordiales pour comprendre les changements en temps réel du flux métabolique cellulaire dans les cellules et les tissus intacts in vitro.
Cet article fournit des protocoles pour la culture des lignées cellulaires dérivées du cancer A549 (adénocarcinome pulmonaire), HepG2/C3A (carcinome hépatocellulaire), MCF-7 (adénocarcinome du sein) et SK-OV-3 (adénocarcinome ovarien) en tant que modèles sphéroïdes 3D in vitro utilisant des approches d’agrégation forcée (Figure 1). Il décrit également en détail comment sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide de l’analyseur Agilent XFe96 XF, (ii) met en évidence les moyens d’optimiser les tests XF à l’aide de sphéroïdes 3D uniques, et (iii) discute des considérations et des limites importantes de la sonde du métabolisme des sphéroïdes 3D à l’aide de cette approche. Plus important encore, cet article décrit comment sont collectés des ensembles de données qui permettent le calcul du taux de consommation d’oxygène (OCR) pour déterminer la phosphorylation oxydative et donc la fonction mitochondriale dans les sphéroïdes cellulaires. Bien qu’il ne soit pas analysé pour ce protocole, le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est un autre paramètre mesuré aux côtés des données OCR dans les expériences XF. Cependant, ECAR est souvent mal ou mal interprété à partir des jeux de données XF. Nous fournissons un commentaire sur les limites du calcul de l’ECAR en suivant les approches de base du fabricant de la technologie.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp ;#86012804</td><td>Lignée cellulaire de carcinome pulmonaire</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>Milieu de dosage XF avec 1 mM HEPES, sans rouge de phénol, bicarbonate de sodium, glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 Analyseur de flux extracellulaire</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Instrument de mesure des taux d’absorption d’oxygène sphéroïde chez les sphéroïdes simples</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial III</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Découpleur de protnophore mitochondrial</td></tr><tr><td>Microplaque à paroi noire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Pour les tests</td></tr> <tr><td>basés sur la fluorescenceCELLSTAR surface répulsive 96 U microplaques à puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Microplaques pour la génération de sphéroïdes</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Dosage pour la détermination de la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes de microtissus 3D</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems, une marque biotechne</td><td>3439-100-01</td><td>Adhésif cellulaire moléculaire pour le revêtement de microplaques sphéroïdes XFe96 pour faciliter la fixation de sphéroïdes</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Supplément pour la culture cellulaire, la croissance et le milieu d’essai XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Milieu de culture pour sphéroïdes HepG2/C3A</td></tr><tr><td>EVOS XL Core Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Microscope d’imagerie à contraste de phase</td></tr><tr><td>EZ-PCR Kit de test de mycoplasmes</td><td>Biological Industries</td><td>20-700-20</td><td>Criblage de mycoplasmes dans les cultures cellulaires</td></tr><tr><td>FIJI Is Just Image J</td><td></td><td></td><td>Analyse des images assemblées</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Supplément pour milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp ;#CRL-10741</td><td>Lignée cellulaire de carcinome hépatique, dérivé clonal de la lignée cellulaire parentale HepG2</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Dosage du lactate dans le milieu de culture sphéoride</td></tr><tr><td>L-glutamine (solution de 200 mM)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Supplément pour la croissance de la culture cellulaire et le milieu de dosage XF</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope M50</td><td>Microsystèmes Leica</td><td>LEICAM50</td><td>Microscope stéréoscopique ; utilisé pour la manipulation des sphéorides</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>Lignée cellulaire d’adénocarcinome mammaire</td></tr><tr><td>Oligomycine de Streptomyces diastatochromogenesMerck</td> <td>Life Science</td><td>O4876</td><td>Inhibiteur de l’ATP synthase</td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibiotiques ajoutés au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen Kit de dosage de l’ADNdb</td><td>Iazote</td><td>P7589</td><td>Analyse de l’ADNdb dans les spehroides</td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial I</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Milieu de culture pour A549, MCF7 et SK-OV-3 sphéroïdes</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Build 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Sphéroïde FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Chaque Seahorse XFe96 Sphéroïde FluxPak contient : 6 microplaques Seahorse XFe96 Sphéroïde (102978-100), 6 cartouches de capteur XFe96 et 1 flacon de Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Pipette sérologique : 5, 10 et 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107 ; 607107 ; 760107</td><td>Consommables pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>#HTB-77</td><td>Lignée</td></tr> <tr><td>cellulaire d’adénocarcinome ovarienPyruvate de sodium (solution de 100 mM)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Supplément pour la croissance des cultures cellulaires et milieu de dosage XF</td></tr><tr><td>T75 cm2 Fiole de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Fioles traitées pour la culture tissulaire pour l’entretien des cultures cellulaires</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle d’ondes</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pointe à orifice large</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Pointes de pipette à large ouverture pour la manipulation de sphéroïdes</td></tr></tbody></table>

exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3d uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Les agrégats cellulaires tridimensionnels (3D), appelés sphéroïdes, sont devenus l’avant-garde de la culture cellulaire in vitro ces dernières années. Contrairement à la culture de cellules en tant que monocouches unicellulaires bidimensionnelles (culture 2D), la culture de cellules sphéroïdes favorise, régule et soutient l’architecture cellulaire physiologique et les caractéristiques qui existent in vivo, y compris l’expression des protéines de matrice extracellulaire, la signalisation cellulaire, l’expression génique, la production de protéines, la différenciation et la prolifération. L’importance de la culture 3D a été reconnue dans de nombreux domaines de recherche, notamment l’oncologie, le diabète, la biologie des cellules souches et le génie tissulaire. Au cours de la dernière décennie, des méthodes améliorées ont été développées pour produire des sphéroïdes et évaluer leur fonction métabolique et leur devenir.
Les analyseurs de flux extracellulaire (XF) ont été utilisés pour explorer la fonction mitochondriale dans des microtissus 3D tels que les sphéroïdes à l’aide d’une plaque de capture d’îlot XF24 ou d’une microplaque sphéroïde XFe96. Cependant, des protocoles distincts et l’optimisation du métabolisme énergétique mitochondrial sondant chez les sphéroïdes à l’aide de la technologie XF n’ont pas été décrits en détail. Cet article fournit des protocoles détaillés pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans des sphéroïdes 3D uniques à l’aide de microplaques sphéroïdes avec l’analyseur XFe96 XF. En utilisant différentes lignées cellulaires cancéreuses, il est démontré que la technologie XF est capable de distinguer la respiration cellulaire dans les sphéroïdes 3D de différentes tailles, mais aussi de différents volumes, numéros de cellules, contenu et type d’ADN.
Les concentrations optimales de composé effecteur mitochondrial d’oligomycine, de BAM15, de roténone et d’antimycine A sont utilisées pour sonder des paramètres spécifiques du métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes 3D. Cet article traite également des méthodes permettant de normaliser les données obtenues à partir de sphéroïdes et aborde de nombreuses considérations qui devraient être prises en compte lors de l’exploration du métabolisme des sphéroïdes à l’aide de la technologie XF. Ce protocole aidera à stimuler la recherche sur des modèles avancés de sphéroïdes in vitro .

Pour obtenir des sphéroïdes compacts et bien formés, chaque lignée cellulaire a été optimisée individuellement pour la densité d’ensemencement et la durée de culture (figure 3). Les lignées cellulaires A549, HepG2/C3A et SK-OV-3 ont initialement formé des agrégats lâches qui n’ont progressé vers des sphéroïdes ronds avec des périmètres clairement définis qu’après 7 jours de culture. Inversement, les cellules MCF-7 pourraient former des sphéroïdes dans les 3 jours. Il y avait une corrélation ...

Ces protocoles aideront les utilisateurs à sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes dérivés de lignées cellulaires cancéreuses 3D à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire Seahorse.

Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Notre protocole permet aux chercheurs de sonder le métabolisme énergétique mitochondrial et les sphéroïdes sans soudure pour permettre des comparaisons entre plusieurs lignées cellulaires, nombres de cellules et phénotypes différents, ainsi que des traitements médicamenteux dans un domaine de la découverte de médicaments et de la recherche sur le cancer. Notre travail présente un protocole détaillé pour explorer le métabolisme énergétique mitochondrial en utilisant des sphéroïdes 3D fournissant le modèle physiologique supérieur par rapport aux expériences de monocouche cellulaire. Les observations biologiques pourraient extrapoler des sphéroïdes vitrés à des tumeurs in vivo et identifier des voies susceptibles de cibler le métabolisme des tumeurs sphéroïdes.Par exemple, l’utilité des glucides pendant la croissance des sphéroïdes. Toutes les données de l’instrument de flux extracellulaire 96 de l’hippocampe sont très sensibles. Le positionnement des sphéroïdes in vitro dans la plaque d’essai est primordial pour obtenir des données précises au niveau du sphéroïde unique.Vérifiez la viabilité des sphéroïdes à l’aide d’un microscope à lumière inversée avec contraste de phase à un grossissement de 4x pour assurer une structure sphéroïde intacte, une morphologie et une uniformité globale entre les échantillons. Pour hydrater la cartouche du capteur, aliquotez environ 20 millilitres du calibrant dans un tube conique. Placez le tube conique contenant l’étrier dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Retirez le contenu du kit d’essai. Placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire. Pipette 200 microlitres d’eau stérile double distillée dans chaque puits de la plaque utilitaire à l’aide d’une pipette P300 multicanal.Placez la cartouche du capteur sur le dessus de la plaque utilitaire. Vérifiez si le niveau d’eau dans chaque puits est suffisamment élevé pour submerger les sondes du capteur. Transférez la cartouche de capteur assemblée dans un incubateur sans dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et laissez-la toute la nuit.Pour recouvrir la microplaque de dosage des sphéroïdes, ajoutez 30 microlitres de solution stérile de 0,1 milligramme par millilitre de poly-D-lysine par puits de microplaque sphéroïde à l’aide d’une technique septique. Aspirer la solution de chaque puits de la microplaque sphéroïde, inverser la plaque et la tapoter fermement sur le papier de soie pour éliminer toute solution résiduelle. Lavez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres d’eau stérile double distillée.Après le lavage final, inverser la microplaque et la tapoter fermement sur du papier de soie pour éliminer toute eau résiduelle. Laissez la plaque sécher à l’air libre pendant 30 minutes avant une utilisation future. Préparez le support XF RPMI comme décrit dans le manuscrit.Préwarmez le milieu de dosage XF RPMI supplémenté à 37 degrés Celsius une heure avant le test. Et préchauffer la microplaque de dosage sphéroïde enduite dans un incubateur non dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius. Retirez le tube conique contenant l’étrier et la cartouche du capteur de l’incubateur à air.Retirez la cartouche du capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers sur la surface de travail. À l’aide d’une pipette multicanal P300, aspirez l’eau de la plaque électrique et jetez-la. Ajouter 200 microlitres de calibrant préavertissé à chaque puits de la plaque utilitaire.Placez la cartouche du capteur sur la plaque d’utilité en vous assurant que les capteurs sont bien immergés dans l’étrier. Transférez la cartouche de capteur assemblée dans l’incubateur à 37 degrés Celsius non dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elle soit prête à charger les solutions d’injection de port. Sortez la plaque de culture sphéroïde de l’incubateur et observez les sphéroïdes au microscope pour assurer leur intégrité avant les étapes de transfert sphéroïde.Chargez 180 microlitres de milieu d’essai préchaud dans chaque puits de la plaque sphéroïde, y compris les puits de correction de fond. Remplissez partiellement une boîte de Petri de sept centimètres avec trois millilitres du milieu d’essai. Transférez les sphéroïdes de la plaque de culture de 96 puits dans une boîte de Pétri, à l’aide d’une pipette multicanal chargée de larges pointes de pipette à orifice et d’un volume réglé sur 10 à 50 microlitres.Réglez le volume d’un pipetteur à canal unique équipé d’une large pointe de pipette à orifice sur 20 microlitres et aspirez soigneusement un seul sphéroïde. Placez la pointe directement au centre de chaque puits de cette microplaque de dosage sphéroïde et laissez l’action capillaire retirer le sphéroïde de la pointe de la pipette. Confirmez l’évolution au microscope en pipetachant le contenu du pipetteur dans la boîte de Pétri.Une fois que tous ces sphéroïdes ont été transférés sur la microplaque d’essai sphéroïde, transférez la plaque dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Préparer les concentrations de stock de travail de chaque composé comme décrit dans le manuscrit, en utilisant un milieu de dosage XF RPMI préavertissé entièrement complété. Distribution de 20 microlitres de la solution de travail de chaque composé dans tous les ports correspondants à l’aide d’une pipette multicanal P100 étalonnée.Préparez l’analyseur pour le chargement de la cartouche du capteur. Pour obtenir des sphéroïdes compacts bien formés, chaque lignée cellulaire a été optimisée individuellement pour la densité d’ensemencement et la durée de culture. Lors de stratégies d’ensemencement optimisées, le volume de sphéroïdes pour SK-OV-3 était d’environ 5,46 x 10 aux sept micromètres cubes et pour A549, il était de 1,45 x 10 à huit micromètres cubes.Tous les types de sphéroïdes avaient une corrélation linéaire entre la densité d’ensemencement initiale et le volume de sphéroïdes. La symétrie sphéroïde parfaite avait une circularité de 1,0 et un écart par rapport à 1,0 indiquait une perte de circularité. Pour tous les types de sphéroïdes, le taux de consommation d’oxygène augmentait avec la taille des sphéroïdes et était linéairement corrélé au volume de sphéroïdes avec le plus élevé dans les sphéroïdes MCF-7 et le plus faible dans les sphéroïdes SK-OV-3.Les sphéroïdes MCF-7 n’ont pas répondu au contrôle du véhicule tout au long de l’expérience. Le taux de consommation d’oxygène dans les sphéroïdes MCF-7 a été réduit avec l’oligomycine après cinq cycles de mesure suivant la première injection de 0,5 microgramme par millilitre. En réponse à BAM15, le taux de consommation d’oxygène a été augmenté avant la deuxième injection.Alors que la combinaison de roténone et d’antimycine A l’a abaissé. Un protocole pour sonder avec précision la respiration mitochondriale basale. La respiration par phosphorylation ADP, la respiration par fuite, l’efficacité du couplage, la capacité respiratoire maximale et la capacité respiratoire de rechange ont été développées à l’aide de sphéroïdes 3D dérivés du cancer.Tous les composés respiratoires ont donné les profils de taux de consommation cinétique d’oxygène attendus pour les composés sélectionnés, révélant un taux de respiration basale stable moyen de 20 à 30 picomoles d’oxygène par minute et par puits. Emplacement des sphéroïdes dans la microplaque et numéro de cycle de mesure après l’injection de composé pour assurer la stabilité des taux de respiration entre les ajouts de composés. Lors de l’exploration de la capacité respiratoire mitochondriale avec des découpleurs, non seulement la concentration est essentielle, mais aussi sa capacité à découpler la respiration en présence d’oligomycine, qui est généralement ajoutée avant le découpleur dans les expériences sondant le métabolisme énergétique mitochondrial.

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Une description d'une méthode de profilage de la fonction mitochondriale dans les cellules est fournie. Le profil mitochondrial généré fournit quatre paramètres de la fonction mitochondriale qui peuvent être mesurées dans une expérience: le taux de respiration basale, l'ATP lié respiration, fuite de protons, et la capacité de réserve.

Expérience profil bioénergétique utilisant cellules C2C12 de myoblastes

Ce protocole décrit la technique permettant d’effectuer un dosage de flux extracellulaire sur des sphéroïdes 3D générés à partir de la co-culture de cellules cancéreuses du pancréas (Patu8902) et de fibroblastes pancréatiques activés (PS1) pour mesurer les deux principales voies de production d’énergie, la glycolyse et la respiration mitochondriale.

Dosage du flux extracellulaire chez les sphéroïdes 3D : méthode de mesure de l’activité métabolique des sphéroïdes de tumeurs pancréatiques

Ici, on décrit une méthode pour la préparation de 3 Dimensions (3D) sphéroïde co-culture de cellules de cancer du pancréas et des fibroblastes, suivies de la mesure des fonctions métaboliques à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.

Préparation et test métabolique des co-cultures 3-dimensional sphéroïde de fibroblastes et de cellules de cancer du pancréas

Cette technique décrit enregistrement en temps réel de la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés souris à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

Le but du présent protocole est d’illustrer l’utilisation de souris néonatales cardiomyocytes comme système modèle pour examiner comment divers facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène au coeur.

Analyse des taux de consommation d’oxygène dans les Cardiomyocytes néonatals cultivés primaires de souris à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire

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Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

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Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

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Découvrez l'analyse du flux extracellulaire Seahorse pour étudier le métabolisme mitochondrial des sphéroïdes 3D en recherche cancéreuse. Cette méthode offre un modèle physiologique supérieur aux cultures monocouches.

Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal

Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire

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