Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline
29 août 2022
Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être une source potentielle de CSM qui se différencient en cellules productrices d’insuline (IPC). Dans ce protocole, nous fournissons des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC épididymiques de rat, suivies d’un protocole simple et court pour la génération d’IPC à partir des mêmes Ad-MSC de rat.
L’objectif global de ce protocole est d’isoler et de caractériser le tissu adipeux rouge, les cellules souches mésenchymateuses séchées et de les différencier en cellules productrices d’insuline à l’aide de méthodes simples. Les cellules souches mésenchymateuses ont trouvé les voies dans le domaine de la génétique. Ils peuvent être isolés à partir de diverses sources telles que la moelle osseuse, le tissu adipeux et le tissu périnatal.
Ils acceptent d’excellentes caractéristiques culturelles. Ils sont multi-puissants et peuvent potentiellement traiter diverses maladies. Le tissu adipeux fournit une riche source de cellules souches mésenchymateuses.
Ces CSM adipeux peuvent être isolés facilement des lipoaspirats avec un rendement élevé par rapport à d’autres sources comme la moelle osseuse. Et ils peuvent fournir une bonne source pour la transplantation autologue et allogénique. Dans cette vidéo présentent un protocole simple pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses de la graisse épididymale de rat.
Cette procédure est une méthode simple et très efficace pour l’isolement. Après isolement, nous subirons la différenciation de ces cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline à l’aide d’un protocole simple et relativement court. Nous commencerons par l’isolement des cellules souches mésenchymateuses adipeuses par digestion collagène de la graisse épididymale pour obtenir une fraction vasculaire plus forte.
Ensuite, les cellules souches mésenchymateuses seront caractérisées par leur adhérence plastique, ainsi que par l’expression de marqueurs CD et la différenciation en plusieurs lignées mésodermiques. Anesthésier l’animal, puis l’euthanasier en utilisant la luxation cervicale. Vaporisez sur tout le corps avec 70% d’éthanol et commencez par l’excision de la peau et des muscles de la partie inférieure de l’abdomen.
Ensuite, exposez les testicules avec la graisse épididymale. Coupez doucement la graisse épididymale. Veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins avec les graisses.
Dans une armoire de biosécurité, coupez le tissu adipeux en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer le tissu adipeux dans un tube centrifuge contenant 10 millilitres de PBS stérile. Commencez le lavage en inclinant le tube Falcon pendant 45 secondes.
Ensuite, gardez le tube debout pendant cinq minutes pour le séparer en deux couches. Retirez le PBS infrané à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Répétez ces étapes de lavage quatre à cinq fois jusqu’à ce que PBS soit clair.
Après le lavage, remettez en suspension le tissu adipeux dans une solution collagène, puis incubez au bain-marie jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène. Ensuite, vortex le mélange de collagène tissulaire pendant 15 secondes, puis centrifuger ensuite pendant cinq minutes. Après centrifugation, vous aurez trois couches.
Jetez soigneusement le surnageant sur la fraction vasculaire stromale. Jetez d’abord soigneusement la couche d’huile en haut, suivie de la couche d’échos sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale. Re-suspendre la fraction vasculaire stromale dans le BSA stérile et re-centrifuger pendant cinq minutes.
Centrifugation entière, placez le support DMEM F-12 complet dans une fiole carrée de 25 centimètres. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre à nouveau la pastille vasculaire stromale dans un milieu DMEM F-12 complet. Et transfert dans la fiole de culture.
Placer dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés 5%. Le lendemain, retirez les cellules non attachées et remplacez le média par un support frais. À partir du lendemain de l’isolement, les cellules de type fibroblaste commenceront à apparaître.
Puis, progressivement, au fil du temps, leur nombre et leur taille augmenteront. En passant, les cellules deviendront plus homogènes. Ces cellules présentent tous les critères de caractérisation des cellules souches mésenchymateuses.
Ces cellules ont été différenciées en cellules productrices d’insuline en utilisant ce protocole simple contenant du nicotinamide bêta-mercaptoéthanol et de l’exendine-4. Tout au long des étapes de différenciation, les cellules commencent à perdre leur forme fibroblastique et je pense que la morphologie des grappes. Lorsqu’elles sont utilisées, les cellules productrices d’insuline présentent une coloration positive de la disithone rouge cramoisi, puis les cellules productrices d’insuline utilisées expriment divers marqueurs de cellules bêta comme Pdx-1, mafA et insuline.
En outre, les cellules productrices d’insuline induites sécrètent des niveaux plus élevés d’insuline dans le surnageant lorsqu’elles sont confrontées à une concentration de glucose plus élevée. Nous avons fourni un protocole détaillé et par étapes pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses. Nous fournissons également ici un protocole relativement court, simple et efficace pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline.
Cela fournit une passerelle aux chercheurs pour entrer dans le domaine des cellules souches mésenchymateuses et étudier leur différenciation en cellules productrices d’insuline.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'isolement et la caractérisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (Ad-MSCs) à partir de tissu épididymaire de rat, suivis de leur différenciation en cellules productrices d'insuline (IPCs). Les méthodes proposées sont simples et conçues pour faciliter leur mise en œuvre en laboratoire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Médecine régénérative
- Endocrinologie
Contexte
- Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent être obtenues à partir de divers tissus, notamment le tissu adipeux.
- Le tissu adipeux constitue une source riche en CSM possédant des caractéristiques de culture favorables.
- Les CSM ont la capacité de se différencier en divers types cellulaires, notamment en cellules productrices d'insuline.
- La compréhension du processus de différenciation peut contribuer au développement de thérapies contre le diabète.
Objectif de l'étude
- Isoler et caractériser les CSM-A du tissu adipeux épididymaire du rat.
- Développer un protocole de différenciation de ces cellules en CPI.
- Fournir une méthode fiable pour les recherches futures en médecine régénérative.
Méthodes utilisées
- Isolation de MSCs dérivées du tissu adipeux à partir de la graisse épididymaire de rat.
- Caractérisation des MSCs isolées à l'aide de marqueurs standards.
- Induction de la différenciation en cellules productrices d'insuline.
- Évaluation de la fonctionnalité des cellules productrices d'insuline après différenciation.
Résultats principaux
- Isolation réussie d'Ad-MSC présentant des marqueurs de surface caractéristiques.
- Démonstration de la différenciation des Ad-MSC en IPC.
- L'évaluation fonctionnelle a montré que les IPC étaient capables de sécréter de l'insuline.
- Le protocole fournit une méthode reproductible pour générer des IPC à partir d'Ad-MSC.
Conclusions
- Les CSMd sont une source viable pour générer des cellules productrices d'insuline.
- Le protocole peut faciliter des recherches supplémentaires sur le traitement du diabète.
- De futures études pourraient explorer le potentiel thérapeutique de ces CIP.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (Ad-MSCs) offrent une source renouvelable et éthiquement non problématique pour la génération de cellules productrices d'insuline (IPCs) dans la recherche sur le diabète. Le protocole décrit une méthode simple et reproductible pour isoler et caractériser les Ad-MSCs à partir de tissu adipeux épididymaire de rat, suivie d'une différenciation en IPCs à l'aide d'inducteurs biochimiques définis. Cette approche soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte précoce de thérapeutiques pour les maladies métaboliques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la multipotence des CSM et leur engagement dans la lignée des cellules bêta pancréatiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit une source standardisée de CSM adipeuses exprimant de façon confirmée CD90, CD73 et CD105, permettant des expériences reproductibles.
- Valeur scientifique : Permet la validation fonctionnelle des CPI par la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) et la coloration au dithizone, confirmant une fonctionnalité similaire à celle des cellules bêta.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des cellules productrices d'insuline qui expriment des facteurs de transcription clés des cellules bêta (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) pour une utilisation dans des tests de criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Permet une production échelonnée de cellules productrices d'insuline à partir de cellules souches mésenchymateuses adipeuses pour une évaluation à haut débit des dynamiques de sécrétion d'insuline.
- Valeur scientifique : Facilite la standardisation des tests grâce à des protocoles de différenciation cohérents utilisant le milieu HG-DMEM, le β-mercaptoéthanol, la nicotinamide et l'énexdine-4.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre une pertinence translationnelle en produisant des CIP qui répondent à des stimulations glucosées par une sécrétion accrue d'insuline.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité préclinique en fournissant une source cellulaire renouvelable pour les tests de relation dose-réponse et d'efficacité dans les modèles de diabète.
- Valeur scientifique : Réduit les risques biologiques en confirmant la multipotence par différenciation ostéogénique, adipogénique et chondrogénique avant l'induction en CIP.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés candidats et l'évaluation préclinique, en particulier pour les thérapeutiques du diabète ciblant le remplacement ou la fonction des cellules bêta.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la plasticité des cellules souches mésenchymateuses et la spécification des lignées à l'aide d'inducteurs de différenciation définis.
- Tri : Permet la production de cellules pancréatiques induites prêtes à l'essai, avec des résultats quantifiables tels que les niveaux de sécrétion d'insuline et l'expression des marqueurs.
- Analyse : Fournit des paramètres mesurables incluant la sécrétion dynamique de glucose en présence d'insuline (GSIS), la coloration au dithizone et la qPCR pour les marqueurs des cellules bêta, permettant de comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie la génération in vitro de cellules pancréatiques induites à la validation préclinique par des tests fonctionnels de libération d'insuline.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour générer des cellules pancréatiques induites à partir de tissu adipeux dans divers projets et lignées cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la génération de cellules IPC grâce à une caractérisation multi-lignées et une validation fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité de l'isolement et de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses (Ad-MSC) entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) dans le développement précoce des thérapies contre le diabète en validant des modèles cellulaires de la fonction des cellules bêta.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des approches basées sur les cellules souches pour les interventions contre les maladies métaboliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, en techniques de différenciation et en cytométrie en flux pour l'immunophénotypage.
- Suppose un accès à des centrifugeuses, des hottes de sécurité biologique, des incubateurs et du matériel pour les tests de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.
- Exige une standardisation des procédures de digestion, de lavage et de mise en culture afin d'assurer un rendement constant de la fraction stromale vasculaire.
- Requiert l'adaptation du moment de différenciation et des concentrations de réactifs lorsqu'on l'applique à différents dépôts adipeux ou espèces.
- Est limité par la nécessité d'utiliser des cellules aux passages 3 à 5 afin d'assurer l'homogénéité et la multipotence avant l'induction de la différenciation.
