Technique modifiée pour l’utilisation de cœurs murins néonatals dans la préparation de Langendorff

Cette approche établit de manière fiable la perfusion rétrograde du cœur de souris néonatal ex vivo en moins de trois minutes. Réduisant ainsi l’âge d’étude le plus jeune possible de plusieurs semaines à 10 jours postnatals. Ce modèle perfusé rétrograde isolé permet d’étudier le cœur néonatal pendant une période critique de développement cardiaque chez une espèce génétiquement modifiable et à faible coût.

Alors que ce modèle se prête à l’étude des réponses physiologiques et pharmacologiques à l’ischémie-reperfusion dans le cœur néonatal. Il pourrait également être utilisé pour l’isolement cardiomyocytaire. Pour fabriquer la canule aortique de souris nouveau-née, utilisez des ciseaux tranchants pour couper la pointe et émousser l’extrémité d’une aiguille en acier inoxydable de calibre 26, en prenant soin de ne pas sertir ou restreindre le diamètre de la lumière de l’aiguille.

Ensuite, lissez le bord coupé pour éliminer les bavures en grattant doucement l’extrémité émoussée sur la paillasse de laboratoire à l’aide d’un mouvement de va-et-vient. Ensuite, fixez la canule fabriquée à l’appareil Langendorff et évaluez l’écoulement et la résistance. Mesurez les débits à travers la canule en collectant et en mesurant la quantité de tampon sur un intervalle d’une minute.

Pour quantifier la différence de pression à travers la canule pendant que le tampon Krebs-Heneseleit s’écoule, mesurez la pression dans le système avec et sans la canule attachée. Calculez ensuite la résistance de la canule à l’aide de la formule suivante. Ensuite, retirez la canule de calibre 26 de l’appareil Langendorff et fixez un tube haute pression au site de canulation de l’appareil.

Ensuite, fixez la canule aortique à l’extrémité distale du tube et désaérez le tube et la canule avec un tampon oxygéné, en veillant à ce que toutes les bulles soient éliminées. Pour prévenir la formation de microthrombi coronaire, administrer une injection intrapéritonéale d’héparine à un chiot de souris de 10 jours à l’aide d’une aiguille de calibre 26 sur une seringue d’un millilitre. Laissez circuler l’héparine pendant plusieurs minutes avant de procéder à l’injection de tout anesthésique.

Ensuite, placez la souris anesthésiée en position couchée et fixez les membres immédiatement après la perte de conscience. Commencez la récolte dès que l’animal ne répond pas au pincement des orteils, car il respire spontanément lors de la dissection initiale. À l’aide de ciseaux à dissection droite, faites une incision subxiphoïde transversale sur la largeur des animaux, exposant la cavité abdominale.

Demandez à un assistant de saisir le processus xiphoïde avec une pince, puis coupez la cage thoracique bilatéralement le long de la ligne axillaire moyenne dans la direction céphalée et réfléchissez le sternum et les côtes crâniennes pour exposer les organes thoraciques. Après avoir identifié le diaphragme de manière supérieure, inciser complètement la partie antérieure. Identifiez la veine cave inférieure infradiaphragmatique au-dessus du foie et transectez-la avec un ciseau Iris incurvé tout en maintenant une légère tension interne en céphalée sur le segment proximal avec une pince Iris.

Ensuite, coupez postérieurement le long de la surface intérieure de la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux Iris incurvés tout en tirant la veine cave inférieure vers le haut et hors de la cavité thoracique. Lorsque le cœur est mobilisé, inclinez les ciseaux vers l’avant et coupez les grands vaisseaux de manière supérieure pour éliminer complètement le cœur et les poumons. Immergez immédiatement le spécimen dans un tampon krebs-Henseleit glacé ou une solution saline.

Le cœur devrait cesser de battre en quelques secondes. Placez un morceau d’essuie-tout au fond d’une boîte de Petri peu profonde pour fournir une friction afin de stabiliser le cœur pendant la canulation. Humidifiez l’essuie-tout avec un tampon Krebs-Henseleit glacé pour empêcher le cœur d’y adhérer.

Placez la boîte de Petri préparée sous le microscope à dissection et ajustez la mise au point. Maintenant, placez la canule aortique attachée au tube d’extension haute pression sous le microscope à dissection, avec une suture de soie 5-0 lâchement attachée autour de son moyeu. Après avoir placé les organes thoraciques excisés dans la boîte de Pétri, identifiez le thymus par son éclat blanc et ses deux lobes et orientez le spécimen de manière à ce que le thymus soit antérieur et supérieur.

Ensuite, à l’aide de pinces, séparez brutalement les lobes du thymus exposant les grands vaisseaux. Ensuite, identifiez l’aorte en localisant les caractéristiques de ramification distinctives de l’arc aortique et transectez-la juste proximale au décollage de l’artère sous-clavière à l’aide de ciseaux fins et tranchants. Maintenant, saisissez doucement l’aorte transectée à l’aide de pinces incurvées fines de style bijoutier et canulez soigneusement l’aorte avec une aiguille émoussée de calibre 26, en prenant soin de ne pas endommager la valve aortique.

À l’aide de pinces incurvées fines, saisissez l’aorte autour de la canule et initiez une perfusion rétrograde pour limiter le temps ischémique. Demandez à l’assistant de saisir les extrémités de la suture lâchement attachée et de piéger soigneusement l’aorte autour de la canule. Pincez la suture au-dessus ou au-dessous de la pince incurvée fine, puis resserrez la suture et confirmez l’adéquation de l’écoulement coronaire.

Débranchez le tube haute pression de l’appareil Langendorff, saisissez le moyeu de la canule et déconnectez l’aiguille émoussée du tube d’extension haute pression. Ensuite, fixez rapidement le moyeu de la canule à l’appareil. Une fois que le cœur est accroché à l’appareil de Langendorff dans la position habituelle, une perfusion adéquate est confirmée.

Coupez soigneusement le poumon, le thymus et l’excès de tissu. Ensuite, incisez l’oreillette droite pour permettre à l’effluent des sinus coronaires de s’égoutter librement. Faites un petit nœud à l’extrémité d’une suture de soie 5-0, puis percez un petit morceau de film de paraffine avec l’aiguille et faites glisser la paraffine jusqu’à l’extrémité nouée.

Passez soigneusement l’aiguille à travers l’apex du ventricule et tirez la suture à travers le cœur jusqu’à ce que le film de paraffine soit bien ajusté contre la paroi latérale du ventricule. Passez l’aiguille à travers l’ouverture de la veste chauffante remplie d’eau de l’appareil Langendorff afin que le cœur puisse être enfermé et réchauffé. Ensuite, fixez l’aiguille au transducteur de force en évitant l’écoulement du sinus coronaire.

Ajustez la suture pour appliquer un à deux grammes de tension basale comme indiqué par la tension diastolique ou le traçage de l’intention du nadir. Placez ensuite des électrodes de surface sur les pôles supérieurs et inférieurs du cœur pour enregistrer l’électrocardiogramme. Enfin, échantillonnez l’effluent des sinus coronaires pour analyse à l’aide d’un cathéter intraveineux de calibre 24.

Des électrodes de surface ont été utilisées pour enregistrer un électrocardiogramme continu, ce qui a permis de déterminer le taux intrinsèque et le rythme. Tous les cœurs correctement perfusés battent spontanément au rythme des sinus. Cette stratégie de perfusion répondait aux besoins métaboliques du cœur de souris nouveau-né, compte tenu de la production négligeable de lactate et de la faible pourcentage d’extraction d’oxygène et de consommation de glucose.

Des moyennes variables physiologiques, telles que la fréquence cardiaque intrinsèque dénervée moyenne et les pressions moyennes de perfusion aortique observées, ont également été enregistrées et calculées. Certains critères d’exclusion tels que le temps nécessaire pour initier la reperfusion, la durée de l’arythmie et la pression de perfusion aortique doivent être pris en compte pour assurer la cohérence de la préparation néonatale. Après l’établissement de la perfusion, une intervention telle que l’administration de médicaments, l’induction d’une lésion d’ischémie-reperfusion, des altérations des métabolites ou l’administration d’agents enzymatiques pour l’isolement cardiomyocytaire peut survenir.