Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol
6 janvier 2022
Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).
L’isolement des champignons entomopathogènes est important pour le développement d’un biopesticide et peut être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. L’utilisation d’appâts à insectes pour isoler les champignons entomopathogènes est considérée comme une méthode peu coûteuse et très efficace. le chloramphénicol, le thiabendazole, le cycloheximide, les milieux artificiels n’utilisent pas de dodine et nécessitent moins d’espace dans le processus d’échantillonnage du sol.
Les étapes critiques comprennent l’étude des plaques CTC après une et deux semaines pour empêcher d’autres champignons de se rétrécir et les champignons entomopathogènes en développement, puis l’identification des colonies de champignons entomopathogènes en fonction de leur macromorphologie et de leur micromorphologie. Commencez par collecter 800 grammes de sol à une profondeur de 10 centimètres à l’aide d’une petite pelle. Conservez les échantillons dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience.
De petites racines peuvent également être collectées car les champignons entomopathogènes sont connus pour avoir une compétence rhizosphère. Pour isoler les champignons à l’aide de chloramphénicol, de thiabendazole, de cycloheximide ou de milieu artificiel sélectif CTC, peser 0,35 gramme de l’échantillon de sol avec ou sans racines. Placez cet échantillon dans un microtube de 1,5 millilitre.
Lorsque vous travaillez dans une armoire de biosécurité, ajoutez un millilitre de suspension aqueuse stérile de 0,01 % de volume de polyoxyéthylène sorbitan à la suspension aqueuse contenant du microtube contenant du sol et vortexez le tube pendant 30 secondes. Une fois terminé, retirez et pipetez 50 microlitres du surnageant sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Utilisez ensuite une spatule stérile Drigalski de six millimètres de diamètre pour disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu.
Incuber les plaques dans des chambres climatiques à 25 degrés Celsius et un minimum de 80% d’humidité relative dans l’obscurité. Après sept, 14 et 21 jours d’incubation, observez les plaques pour la croissance des colonies fongiques. Isoler les champignons à l’aide de galleria mellonella désinfectés en surface et de larves de Stade avancé de Tenebrio molitor comme appâts pour insectes.
Immerger la larve dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute pour la stérilisation. Ensuite, lavez les larves deux fois avec de l’eau stérile. Assemblez les appâts dans des pots en plastique avec 10 petits trous de 10 millimètres de diamètre dans le couvercle contenant 250 grammes du sol collecté.
Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol et analyser les pots quotidiennement, à la recherche d’insectes morts. Après avoir retiré les insectes morts du pot, stérilisez superficiellement les insectes avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute. Pour favoriser la mycose, placez les insectes stériles dans une chambre humide à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius pendant sept jours.
Sur la mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte et, à l’aide de la boucle microbiologique, placez les conidies sur un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre contenant 0,05% de chloramphénicol ou de milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Et incuber les plaques de culture dans une chambre climatique comme expliqué précédemment.
Après 14 jours d’incubation, identifiez les espèces EPF en analysant les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques telles que décrites dans le manuscrit. Ensuite, transférez les conidies aériennes dans des cultures de glissement pendant trois jours à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius. Après trois jours, colorez la lame avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques.
Au microscope optique, observez les structures fongiques telles que l’arrangement, les conidiophores, la forme et la taille des conidies à 400 fois et confirmez l’identification EPF. Dans l’étude, 51 souches EPF des espèces Metarhizium et Beaveria ont été isolées à partir de 524 échantillons de sol. L’analyse représentative montre les caractéristiques micromorphologiques de quelques isolats d’espèces de Metarhizium et de Beaveria.
La présence d’EPF dans les 24 échantillons de sol a été étudiée à l’aide de trois méthodes d’isolement différentes. L’appât Galleria mellonella s’est avéré plus efficace dans l’isolement, suivi de l’appât tenebrio molitor et du milieu CTC. Les mêmes 24 échantillons de sol n’ont montré aucune récupération d’espèces de Beaveria, mais seulement de Metarhizium.
Les choses les plus importantes à retenir sont le transfert des conidies aériennes sur une couche de lame en observant les caractéristiques du microscope et en confirmant l’identification des champignons entomopathogènes à l’aide de clés morphologiques. D’autres méthodes comprennent l’utilisation d’autres milieux artificiels sélectifs avec un produit chimique spécifique pour réduire la croissance de contaminants tels que la dodine. La recherche de nouveaux isolats fongiques avec des caractéristiques de contrôle biologique exceptionnelles est cruciale pour accroître l’efficacité des champignons dans la lutte contre les arthropodes nuisibles et explorer d’autres questions dans le domaine de la pathologie des invertébrés.
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Aperçu
Cette étude examine l'isolement de champignons entomopathogènes à partir de sols tropicaux en utilisant des appâts insectes, en mettant en évidence l'efficacité de différentes méthodes. L'isolement vise à approfondir la compréhension de la diversité fongique et à contribuer au développement de biopesticides.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Champignons entomopathogènes
- Microbiologie du sol
- Développement de biopesticides
Contexte
- Méthodes peu coûteuses pour l'isolement des champignons entomopathogènes.
- Importance de l'évaluation des échantillons de sol pour les études écologiques.
- Utilisation de milieux sélectifs pour un isolement efficace des champignons.
Méthodes utilisées
- Isolation des champignons à l'aide d'appâts insectes (Galleria mellonella et Tenebrio molitor).
- Utilisation de milieux artificiels sélectifs (milieu CTC, gélose au dextrose de pomme de terre).
- Observation microscopique pour l'identification des espèces fongiques.
Résultats principaux
- 51 souches de Metarhizium et d'espèces de Beauveria isolées à partir de 524 échantillons de sol.
- L'appât Galleria mellonella a démontré l'efficacité la plus élevée pour l'isolement fongique.
- Aucun isolement d'espèces de Beauveria à partir des échantillons testés.
Conclusions
- L'étude démontre efficacement des méthodes d'isolement des champignons entomopathogènes.
- Les résultats contribuent à la recherche en biocontrôle et à des applications agricoles potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement des champignons entomopathogènes à partir du sol constitue une étape fondamentale dans la découverte de biopesticides, où l'efficacité de la méthode influence directement la validation des cibles et l'identification des candidats prometteurs. La comparaison entre l'utilisation d'appâts insectes et des milieux sélectifs permet de réduire les risques lors du criblage précoce de candidats antifongiques en améliorant le rendement d'isolement et en diminuant les faux négatifs. Cela renforce la fiabilité prédictive dans le choix des cibles pour les programmes de lutte contre les ravageurs arthropodes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de la biodiversité fongique dans les écosystèmes du sol afin d'identifier de nouvelles souches de Metarhizium et de Beauveria possédant une bioactivité potentielle.
- Valeur opérationnelle : Les méthodes d'appâtage à base d'insectes (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) offrent une efficacité d'isolement supérieure à celle du milieu CTC, facilitant ainsi l'accès aux organismes cibles pour leur caractérisation ultérieure.
- Valeur translationnelle : Les souches isolées permettent une réduction mécanistique des risques en reliant la virulence phénotypique à l'identité génétique par une identification morphologique et moléculaire.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des isolats fongiques validés pour le développement de tests ciblant la pathogénicité vis-à-vis des arthropodes et la spécificité d'hôte.
- Valeur opérationnelle : Des protocoles d'isolement normalisés utilisant des appâts insectes améliorent la reproductibilité et la montée en échelle du retrait des champignons à partir de lots d'échantillons de sol.
- Préparation aux tests : Permet la préparation de cultures pures en vue de la récolte de conidies et de la confirmation morphologique sur lame, soutenant ainsi des entrées fiables pour le criblage phénotypique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Système pertinent pour les maladies : Les souches d'EPF isolées servent de modèles précliniques pour évaluer la virulence contre les ravageurs insectes, ce qui s'inscrit dans le développement de produits de biocontrôle.
- Fiabilité prédictive : L'identification moléculaire des isolats au niveau de l'espèce renforce la confiance dans la cible et appuie le choix des souches pour les études de formulation.
- Continuité : Les protocoles d'isolement établis permettent un suivi longitudinal de la présence des champignons dans les sols agricoles, éclairant ainsi les stratégies de gestion de la résistance et de rotation des souches.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode d'isolement s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où les souches de champignons entomopathogènes récupérées passent à un criblage phénotypique pour évaluer la virulence et la spécificité de l'hôte, ce qui permet d'identifier les souches candidates dans les pipelines de bioinsecticides.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en écologie fongique et en pathogénicité en facilitant le rétablissement des champignons entomopathogènes à partir de matrices de sol complexes.
- Écrantage : Génère des préparations fongiques normalisées pour des tests de virulence à haut débit utilisant des insectes hôtes.
- Analytique : Les résultats d'identification morphologique et moléculaire fournissent des données quantitatives et qualitatives pour la comparaison et la sélection de souches.
- Recherche translationnelle : Relie l'isolement environnemental à l'évaluation préclinique par le biais de mécanismes de virulence conservés chez Metarhizium et Beauveria.
- Réutilisation à grande échelle : Le protocole d'isolement utilisant des appâts insectes peut être standardisé entre différents sites et types de sol, permettant une banque évolutive de souches fongiques destinée à des campagnes d'écrantage futures.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la diversité des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles de champignons entomopathogènes (EPF) pour le développement de biopesticides.
- Valeur opérationnelle : Les méthodes d'appâts insecticides offrent un rendement plus élevé et une variabilité technique moindre que les milieux sélectifs, améliorant ainsi les taux de réussite d'isolement.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions « aller/ne pas aller » lors de la priorisation des souches en augmentant l'accès à des isolats virulents provenant d'échantillons environnementaux.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l'avancement ajusté au risque en élargissant la pool de souches d'EPF caractérisées avec morphologie et identité confirmées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation d'insectes, en morphologie fongique et en technique aseptique pour la préparation des appâts et la récolte des conidies.
- Exige des chambres d'incubation à climat contrôlé capables de maintenir une température de 25 °C et une humidité de 80 % pour la croissance fongique et l'induction de la mycose.
- La standardisation entre les équipes exige une stérilisation uniforme des appâts, une homogénéisation constante du sol et des délais rigoureux pour le traitement post-mycose.
- L'adaptation à différents types de sol peut nécessiter des ajustements du temps d'exposition des appâts et du volume de sol en fonction de la prévalence naturelle des champignons entomopathogènes.
- Les limites incluent la dépendance à la viabilité des larves et aux conditions environnementales affectant le succès de la mycose, comme indiqué dans le protocole qui repose sur l'utilisation de chambres humides et d'étapes de stérilisation de surface.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
