Name: Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Découvrez l'isolement des champignons entomopathogènes à partir d'échantillons de sols tropicaux en utilisant des appâts d'insectes comme Galleria mellonella. Cette méthode efficace contribue au développement de biopesticides et à la recherche en lutte biologique.

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Cette étude a été financée en partie par la Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) du Brésil, code financier 001, fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numéro de projet E-26/010.001993/2015), et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) du Brésil.

Comme la présente étude a accédé au patrimoine génétique brésilien, la recherche a été enregistrée auprès du Système national de gestion du patrimoine génétique et des connaissances traditionnelles associées (Sisgen) sous le code AA47CB6.
1. Échantillonnage du sol
<ol><li>Prélever 800 g de terre (avec ou sans racines secondaires incidentes) à une profondeur de 10 cm à l’aide d’une petite pelle. Conservez-les dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience. REMARQUE: Les petites racines peuvent également être collectées car les FPE auraient une compétence en matière de rhizosphère. Plus le traitement des échantillons est rapide, mieux c’est, car les spores fongiques peuvent être moins viables au fil du temps. Dans la présente étude, les échantillons ont été analysés au plus tard 7 jours après le prélèvement.</li>
	<li>Utilisez un GPS pour identifier l’emplacement des échantillons prélevés en latitude et longitude et classez la zone collectée en fonction du type de sol (par exemple, prairies, forêt tropicale indigène, rives de lacs ou terres cultivées).</li>
</ol>2. Méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes
<ol><li>Isolement à l’aide d’un milieu artificiel sélectif CTC.<ol>
<li>Pour préparer le milieu CTC [gélose au dextrose de pomme de terre plus extrait de levure (PDAY) complété par 0,5 g/L de chloramphénicol, 0,001 g/L de thiabendazole et 0,25 g/L de cycloheximide9], peser tous les réactifs individuellement, les mélanger dans de l’eau distillée et stériliser le milieu en autoclave. Dans une armoire de biosécurité, plaquer 23 mL du milieu dans des plaques de Petri de 60 mm x 15 mm. ATTENTION : Lorsque vous pesez les réactifs CTC, utilisez une blouse de laboratoire, un masque, des gants et des lunettes, car le cycloheximide et le chloramphénicol sont toxiques.</li>
		<li>Peser 0,35 ± 0,05 g de chaque échantillon de sol (avec ou sans racines) et le placer dans un microtube de 1,5 mL.</li>
		<li>Dans une armoire de biosécurité, ajouter 1 mL de suspension aqueuse stérile de polyoxyéthylène sorbitan monooléate de 0,01 % (vol/vol) au microtube contenant du sol et du vortex pendant 30 s.</li>
		<li>Retirer 50 μL du surnageant et le pipeter sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu à l’aide d’une spatule stérile Drigalski (6 mm de diamètre). REMARQUE : Au moins trois répliques pour chaque échantillon de sol doivent être préparées.</li>
		<li>Incuber les plaques dans des chambres climatiques (25 ± 1 °C, humidité relative ≥80%) dans l’obscurité et observer la croissance des colonies fongiques après 7, 14 et 21 jours d’incubation.</li>
		<li>Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques à la recherche d’EPF. Transférer les cultures EPF dans un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre plus 0,05 % de chloramphénicol (PDAC) jusqu’à l’obtention de cultures pures. REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement à l’aide d’appâts à insectes<ol>
<li>Utilisez des larves de G. mellonella et de T. molitor à un stade avancé désinfectées en surface. Immerger les larves dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min pour la stérilisation. Lavez les larves deux fois à l’aide d’eau stérile. NOTE: Les larves de G. mellonella du quatrième stade ont été utilisées dans la présente étude. Les stades larvaires de T. molitor n’étaient pas normalisés.</li>
		<li>Utilisez des pots en plastique pour assembler les appâts. Ajouter 250 g de terre collectée à chaque pot en plastique (98 mm de largeur x 47 mm de hauteur x 142 mm de longueur). Séparer 15 larves de chaque espèce (T. molitor et G. mellonella) et déposer cinq larves par pot en plastique. Conservez les pots à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % dans l’obscurité. REMARQUE: Percez 10 petits trous (2 mm de diamètre) dans les couvercles du pot pour permettre la ventilation. Un dispositif de fer chauffé tranchant peut être utilisé pour percer les trous.</li>
		<li>Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol. REMARQUE: L’humidité est importante pour soutenir l’infection fongique des larves. Pour maintenir l’humidité dans le sol, vaporisez de l’eau distillée stérile à la surface du sol chaque fois que nécessaire. Ne pas tremper l’échantillon de sol dans l’eau.</li>
		<li>Analysez quotidiennement les pots à la recherche d’insectes morts. REMARQUE: Observez quotidiennement les larves restantes dans la colonie à la recherche de signes pathologiques d’invertébrés pour vous assurer que les insectes ne sont pas infectés. Comme alternative, des pots de contrôle avec un sol stérile peuvent être inclus dans l’étude pour vérifier l’état de santé des larves d’insectes.</li>
		<li>Enlevez les insectes morts et stérilisez-les superficiellement avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min. Placer les insectes stériles dans une chambre humide (humidité relative ≥ 80%) à 25 ± 1 °C pendant 7 jours pour favoriser l’extériorisation des champignons entomopathogènes (mycose).</li>
		<li>En cas de mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte. Utilisez une boucle microbiologique pour placer les conidies sur un milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Incuber les plaques de culture dans une chambre climatique à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.</li>
		<li>Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques sur les plaques pour confirmer l’identité de l’EPF. Répéter la culture sur PDAC jusqu’à ce que des colonies fongiques pures soient obtenues. REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identification des EPF (Metarhizium spp. et Beauveria spp.)
<ol><li>Analyser les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques (c.-à-d. la surface et l’inverse des colonies, leur forme, leur bord, leur taux de croissance, leur couleur, leur texture, leur pigment diffusible, les exsudats et les conidies aériennes) après 14 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.</li>
	<li>Transférer les conidies aériennes dans des cultures sur lames (technique de microculture)16 pendant 3 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % et tacher avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques (c.-à-d. disposition des conidies, des conidiophores, de la forme et de la taille des conidies)17,18,19,20.</li>
	<li>Observez les structures fongiques microscopiques à 400x à l’aide d’un microscope optique pour confirmer l’identification EPF. NOTE: Les clés morphologiques pour l’EPF sont décrites dans les rapports de Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., et Humber 17,18,19,20. La macro et la micromorphologie des colonies fongiques sont les critères les plus fréquemment utilisés pour identifier les champignons filamenteux au niveau du genre. Selon le genre de l’EPF, ces caractéristiques morphologiques vont changer. Humber20 présente une clé d’identification des principaux genres d’entomopathogènes fongiques. Les colonies de Metarhizium spp., par exemple, sont généralement circulaires, poudreuses, présentant différentes nuances de vert et peuvent présenter de l’exsudat. Au microscope, ces colonies ont des cellules conidiogènes apicales sur des conidiophores largement ramifiés, densément entrelacés formant un hyménium compact, et des conidies cylindriques à ellipsoïdes en chaînes parallèles formant des colonnes ou des masses en forme de plaque. Les colonies de Beauveria spp. sont généralement blanches, poudreuses ou cotonnières. Ils présentent des cellules conidiogènes avec une partie basale dilatée s’étendant apicalement dans une direction en zigzag. Les conidiophores de Beauveria forment des amas denses de conidies en forme de globe. Des analyses moléculaires sont nécessaires pour l’identification de la FPE au niveau de l’espèce.</li>
	<li>Effectuer des analyses moléculaires sur les isolats pour l’identification taxonomique au niveau de l’espèce. Pour les souches EPF isolées dans cette étude, à savoir Metarhizium spp. et Beauveria spp., effectuer des analyses moléculaires basées sur les rapports de Bischoff et al.17 et Rehner et al.18.</li>
	<li>Après avoir confirmé que les isolats sont des EPF, déposez les isolats dans une collection de cultures fongiques. Dans la présente étude, les isolats ont été déposés dans la collection de cultures fongiques entomopathogènes du Laboratoire de contrôle microbien (LCM) de l’Université rurale fédérale de Rio de Janeiro.</li>
</ol>

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<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+entomopathogen+isolation%3A+A+case+of+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi.</a> Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).</li>
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<li>Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi+in+Portuguese+vineyards+soils%3A+suggesting+a+%27Galleria-Tenebrio-bait+method%27+as+bait-insects+Galleria+and+Tenebrio+significantly+underestimate+the+respective+recoveries+of+Metarhizium+%28robertsii%29+and+Beauveria+%28bassiana%29%5BTitle%5D)+AND+%22MycoKeys%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana).</a> MycoKeys. 38, 1-23 (2018).</li>
<li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li>
<li>Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilocus+phylogeny+of+the+Metarhizium+anisopliae+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage.</a> Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).</li>
<li>Rehner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+systematics+of+the+anamorphic%2C+entomopathogenic+genus+Beauveria%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria.</a> Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).</li>
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<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+insect+pathogenic+soil+fungi+in+Switzerland+with+special+reference+to+Beauveria+brongniartii+and+Metharhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+field+persistence+of+Beauveria+brongniartii+strains+applied+as+biocontrol+agents+against+European+cockchafer+larvae+in+Switzerland%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland.</a> Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).</li>
<li>Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+occurrence+of+soil-borne+entomopathogenic+fungi+in+the+Moroccan+endemic+forest+of+Argania+spinosa+and+their+pathogenicity+to+Ceratitis+capitata%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).</li>
<li>Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+entomopathogenic+fungal+species+Metarhizium+flavoviride+associated+with+agricultural+crops+in+Denmark%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).</li>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les habitats naturels et agricoles des sols sont des environnements typiques de l’EPF22 et constituent un excellent réservoir naturel. Dans la présente étude, deux méthodes d’isolement de la FPE à l’aide d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif ont été abordées. La première étape de l’isolement est la collecte des échantillons de sol. Un stockage et une identification appropriés des échantillons de sol sont essentiels. L’information sur la latitude, la longitude, le type de sol et le b...

Le sol est la source de plusieurs micro-organismes, dont les champignons entomopathogènes (EPF). Ce groupe particulier de champignons est reconnu par leur capacité à coloniser et souvent à tuer les hôtes arthropodes, en particulier les insectes1. Après isolement, caractérisation, sélection de souches virulentes et enregistrement, les EPF sont produits en masse pour la lutte contre les arthropodes nuisibles, ce qui confirme leur pertinence économique2. En conséquence, l’isolement du FPE est considéré comme la première étape du développement d’un biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) et Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sont les champignons les plus couramment utilisés pour la lutte contre les arthropodesnuisibles 3. Les EPF ont été isolés avec succès du sol, des arthropodes présentant une mycose visible, des plantes colonisées et de la rhizosphère végétale 4,5.
L’isolement de l’EPF peut également être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. La littérature récente a rapporté que l’utilisation de l’EPF est sous-estimée, citant plusieurs applications non conventionnelles de l’EPF telles que leur capacité à améliorer la croissance des plantes4, à éliminer les contaminants toxiques du sol et à être utilisée en médecine6. La présente étude vise à comparer l’efficacité de l’isolement de l’EPF du sol à l’aide d’appâts à insectes par rapport au milieu de culture artificiel 7,8,9. L’utilisation de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) comme appât pour insectes dans le contexte de l’isolement de la FPE a été bien acceptée. Ces larves sont utilisées dans le monde entier par la communauté scientifique comme modèle expérimental pour étudier les interactions hôte-pathogène10,11. La larve de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) est considérée comme un autre modèle d’insecte pour les études impliquant la virulence et pour l’isolement de l’EPF puisque cet insecte est facile à rarer en laboratoire à faible coût 7,12.
Des méthodes indépendantes de la culture, telles que l’utilisation de diverses techniques de PCR, peuvent être appliquées pour détecter et quantifier l’EPF sur leurs substrats, y compris le sol13,14. Néanmoins, pour isoler correctement ces colonies fongiques, leur substrat doit être cultivé sur un milieu artificiel sélectif9, ou les champignons présents dans les échantillons peuvent être appâtés à l’aide d’insectes sensibles15. D’une part, le CTC est un milieu artificiel sans dodine qui se compose de gélose au dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide. Ce médium a été développé par Fernandes et al. 9 pour maximiser la récupération de Beauveria spp. et Metarhizium spp. naturels du sol. D’autre part, les larves de G. mellonella et de T. molitor peuvent également être utilisées avec succès comme appâts pour obtenir des isolats d’EPF du sol. Néanmoins, selon Sharma et al.15, moins d’études ont rapporté l’utilisation concomitante et la comparaison de ces deux insectes appâts. Les sols des vignobles portugais ont montré des récupérations importantes de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin utilisant T. larves de molitor par rapport aux larves de G. mellonella; en revanche, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L’isolement de Vuill était lié à l’utilisation d’appâts G. mellonella 15. Par conséquent, la décision sur la méthode d’isolement EPF à utiliser (c.-à-d. G. mellonella-appât, T. molitor-appât ou milieu CTC) devrait être envisagée en fonction de l’objectif de l’étude et de l’infrastructure du laboratoire. L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler le FPE à partir d’échantillons de sol.

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td>Phoenix Luferco</td><td>9451</td><td></td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>Airstream ESCO</td><td>AC2-4E3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chambres climatiques</td><td>Eletrolab</td><td>EL212/3</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>RBR</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Spatule Drigalski</td><td>Marienfeld</td><td>1800024</td><td></td></tr><tr><td>Application GPS</td> Application de <td>géolocalisation</td><td>2.1.2005</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de lactophénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Axio star plus</td><td>1169 149</td><td></td></tr><tr><td>Caméra microscope</td><td>Zeiss Axiocam 105 couleur</td><td>426555-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope softwere</td><td>Zen lite Zeiss 3.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>Olen</td><td>k5-7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Microtube</td><td>BRAND</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Petri</td><td>Kasvi</td><td>K30-6015</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette</td><td>Vatten</td><td>VT-230-200C/VT-230-1000C</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>HTL - Labmatepro</td><td>LMP 200 / LMP 1000</td><td></td></tr><tr><td>Pots en plastique</td><td>Prafesta descart&aacute ; veis</td><td>8314</td><td></td></tr><tr><td>Sacs en polypropylène</td><td>Extrusa</td><td>38034273/5561</td><td></td></tr><tr><td>Gélose au dextrose de pomme de terre</td><td>Kasvi</td><td>K25-1022</td><td></td></tr><tr><td>Prism software 9.1.2</td><td>Pelle à tampon</td><td></td><td></td>graphique</tr><tr><td></td><td>Tramontina</td><td>77907009</td><td></td></tr><tr><td>Tenebrio mollitor</td><td>Safari</td><td>QP98DLZ36</td><td></td></tr><tr><td>Thiabendazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8904</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortex Biomixer</td><td>QL-901</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Kasvi</td><td>K25-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Le sol est un habitat riche pour les micro-organismes, y compris l’EPF appartenant en particulier aux genres Metarhizium et Beauveria, qui peuvent réguler les arthropodes nuisibles. Les produits biologiques à base de champignons sont disponibles sur le marché principalement pour la lutte antiparasitaire des arthropodes agricoles. Néanmoins, malgré la grande biodiversité endémique, seules quelques souches sont utilisées dans les bioproduits commerciaux dans le monde entier. Dans la présente étude, 524 échantillons de sol ont été cultivés sur de la gélose de dextrose de pomme de terre enrichie d’extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC). La croissance des colonies fongiques a été observée pendant 3 semaines. Tous les Metarhizium et Beauveria EPF ont été identifiés morphologiquement au niveau du genre. De plus, certains isolats ont été identifiés moléculairement au niveau de l’espèce. Vingt-quatre de ces 524 échantillons de sol ont également été étudiés pour la présence de FPE à l’aide de la méthode des appâts à insectes (Galleria mellonella et Tenebrio molitor). Au total, 51 souches d’EPF ont été isolées (41 Metarhizium spp. et 10 Beauveria spp.) à partir des 524 échantillons de sol. Toutes les souches fongiques ont été isolées dans des terres cultivées ou des prairies. Sur les 24 échantillons sélectionnés à des fins de comparaison, 91,7 % étaient positifs pour l’EPF utilisant l’appât Galleria , 62,5 % utilisant l’appât Tenebrio et 41,7 % utilisant le CTC. Nos résultats suggèrent que l’utilisation d’appâts à insectes pour isoler le FPE du sol est plus efficace que l’utilisation du milieu CTC. La comparaison des méthodes d’isolement en plus de l’identification et de la conservation du FPE a un impact positif sur les connaissances sur la biodiversité. L’amélioration de la collecte du FPE soutient le développement scientifique et l’innovation technologique.

Au total, 524 échantillons de sol ont été prélevés dans des prairies : pâturages pour le bétail (165 échantillons), forêts tropicales indigènes (90 échantillons), lacs (42 échantillons) et terres cultivées/cultivées (227 échantillons) entre 2015 et 2018 dans l’État de Rio de Janeiro, au Brésil. Les coordonnées géographiques des échantillons positifs pour le FPE sont donnés dans le tableau supplémentaire 1.
Sur les 524 échantillons de sol, 500 échantillons ont été analysés uniq...

Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

L’isolement des champignons entomopathogènes est important pour le développement d’un biopesticide et peut être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. L’utilisation d’appâts à insectes pour isoler les champignons entomopathogènes est considérée comme une méthode peu coûteuse et très efficace. le chloramphénicol, le thiabendazole, le cycloheximide, les milieux artificiels n’utilisent pas de dodine et nécessitent moins d’espace dans le processus d’échantillonnage du sol.Les étapes critiques comprennent l’étude des plaques CTC après une et deux semaines pour empêcher d’autres champignons de se rétrécir et les champignons entomopathogènes en développement, puis l’identification des colonies de champignons entomopathogènes en fonction de leur macromorphologie et de leur micromorphologie. Commencez par collecter 800 grammes de sol à une profondeur de 10 centimètres à l’aide d’une petite pelle. Conservez les échantillons dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience.De petites racines peuvent également être collectées car les champignons entomopathogènes sont connus pour avoir une compétence rhizosphère. Pour isoler les champignons à l’aide de chloramphénicol, de thiabendazole, de cycloheximide ou de milieu artificiel sélectif CTC, peser 0,35 gramme de l’échantillon de sol avec ou sans racines. Placez cet échantillon dans un microtube de 1,5 millilitre.Lorsque vous travaillez dans une armoire de biosécurité, ajoutez un millilitre de suspension aqueuse stérile de 0,01 % de volume de polyoxyéthylène sorbitan à la suspension aqueuse contenant du microtube contenant du sol et vortexez le tube pendant 30 secondes. Une fois terminé, retirez et pipetez 50 microlitres du surnageant sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Utilisez ensuite une spatule stérile Drigalski de six millimètres de diamètre pour disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu.Incuber les plaques dans des chambres climatiques à 25 degrés Celsius et un minimum de 80% d’humidité relative dans l’obscurité. Après sept, 14 et 21 jours d’incubation, observez les plaques pour la croissance des colonies fongiques. Isoler les champignons à l’aide de galleria mellonella désinfectés en surface et de larves de Stade avancé de Tenebrio molitor comme appâts pour insectes.Immerger la larve dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute pour la stérilisation. Ensuite, lavez les larves deux fois avec de l’eau stérile. Assemblez les appâts dans des pots en plastique avec 10 petits trous de 10 millimètres de diamètre dans le couvercle contenant 250 grammes du sol collecté.Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol et analyser les pots quotidiennement, à la recherche d’insectes morts. Après avoir retiré les insectes morts du pot, stérilisez superficiellement les insectes avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute. Pour favoriser la mycose, placez les insectes stériles dans une chambre humide à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius pendant sept jours.Sur la mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte et, à l’aide de la boucle microbiologique, placez les conidies sur un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre contenant 0,05% de chloramphénicol ou de milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Et incuber les plaques de culture dans une chambre climatique comme expliqué précédemment.Après 14 jours d’incubation, identifiez les espèces EPF en analysant les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques telles que décrites dans le manuscrit. Ensuite, transférez les conidies aériennes dans des cultures de glissement pendant trois jours à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius. Après trois jours, colorez la lame avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques.Au microscope optique, observez les structures fongiques telles que l’arrangement, les conidiophores, la forme et la taille des conidies à 400 fois et confirmez l’identification EPF. Dans l’étude, 51 souches EPF des espèces Metarhizium et Beaveria ont été isolées à partir de 524 échantillons de sol. L’analyse représentative montre les caractéristiques micromorphologiques de quelques isolats d’espèces de Metarhizium et de Beaveria.La présence d’EPF dans les 24 échantillons de sol a été étudiée à l’aide de trois méthodes d’isolement différentes. L’appât Galleria mellonella s’est avéré plus efficace dans l’isolement, suivi de l’appât tenebrio molitor et du milieu CTC. Les mêmes 24 échantillons de sol n’ont montré aucune récupération d’espèces de Beaveria, mais seulement de Metarhizium.Les choses les plus importantes à retenir sont le transfert des conidies aériennes sur une couche de lame en observant les caractéristiques du microscope et en confirmant l’identification des champignons entomopathogènes à l’aide de clés morphologiques. D’autres méthodes comprennent l’utilisation d’autres milieux artificiels sélectifs avec un produit chimique spécifique pour réduire la croissance de contaminants tels que la dodine. La recherche de nouveaux isolats fongiques avec des caractéristiques de contrôle biologique exceptionnelles est cruciale pour accroître l’efficacité des champignons dans la lutte contre les arthropodes nuisibles et explorer d’autres questions dans le domaine de la pathologie des invertébrés.

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