Name: Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Découvrez des méthodes non invasives pour localiser les protéines membranaires des photorécepteurs et évaluer la dégénérescence rétinienne chez Drosophila. Ces techniques d'imagerie par fluorescence eGFP permettent d'étudier les bases moléculaires des cécités héréditaires humaines.

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Nous tenons à remercier nos étudiants chercheurs au fil des ans. En particulier, Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim et Laura Jaggy, dont les données ont été utilisées dans ce protocole comme résultats représentatifs. La recherche de notre groupe présentée ici a été financée par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) à Armin Huber.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’applicabilité des protéines de fluorescence et la simplicité du dépistage par imagerie DPP et microscopie rétinienne par immersion dans l’eau se sont avérées efficaces par de nombreux groupes12. Des stratégies similaires à celles présentées ici ont été utilisées dans plusieurs tests génétiques pour détecter des défauts dans les niveaux d’expression de la rhodopsine, l’homéostasie, l’organisation rétinienne ou l’intégrité cellulaire à l’aide de Rh1::eGFP 17,18,19,20,2...

En délivrant et en éliminant les protéines vers et depuis la membrane plasmique, le trafic de protéines membranaires dans les neurones contrôle l’équipement de la membrane plasmique avec des récepteurs ainsi que des canaux ioniques et, par conséquent, régule la fonction neuronale. Une mauvaise régulation ou des défauts dans le trafic des protéines ont généralement des effets néfastes sur les cellules et entraînent une dégénérescence neuronale. Chez l’homme, cela peut provoquer des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson ou la rétinite pigmentaire1. Les photorécepteurs dans l’œil composé de Drosophila melanogaster sont devenus un système modèle in vivo pour l’étude du trafic de protéines membranaires2. Cela n’est pas seulement dû à la polyvalence génétique de la drosophile qui permet des criblages génétiques efficaces, mais aussi parce que tous les composants essentiels de la membrane photoréceptrice absorbant la lumière sont caractérisés en détail et que des techniques microscopiques efficaces sont disponibles qui peuvent être appliquées à l’œil de la mouche. Ces techniques sont au centre de cet article.
Dans les cellules photoréceptrices de la drosophile, la membrane plasmique apicale forme une pile dense de microvillosités le long d’un côté de la cellule, appelée rhabdomere. Les rhabdomeres des cellules photoréceptrices R1-6 sont disposées selon un motif trapézoïdal caractéristique tandis que les cellules photoréceptrices R7 et R8 forment un seul rhabdomere au centre de ce trapèze3. Le trafic de protéines membranaires est nécessaire pour un renouvellement régulé des protéines de la membrane rhabdomerale telles que la rhodopsine et les canaux ioniques TRP (potentiel récepteur transitoire) et TRPL (TRP-like) activés par la lumière afin d’assurer la quantité appropriée de ces protéines de phototransduction dans le rhabdomere. Les protéines de la membrane photoréceptrice sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique et transportées via l’appareil de Golgi vers le rhabdomere. Après l’activation de la rhodopsine par la lumière, une molécule de rhodopsine peut soit être inactivée par absorption d’un deuxième photon, soit être retirée du rhabdomere par endocytose médiée par la clathrine. La rhodopsine endocytosée se dégrade dans le lysosome ou est recyclée en rhabdomere 4,5. Le canal ionique TRPL est également internalisé après activation de la cascade de phototransduction et subit une translocation dépendante de la lumière entre le rhabdomere (où il est situé lorsque les mouches sont maintenues dans l’obscurité) et un compartiment de stockage enrichi en ER dans le corps cellulaire (vers lequel il est transporté en quelques heures après l’illumination)6,7,8,9,10 . Contrairement à la rhodopsine endocytosée, seules de petites quantités de TRPL sont dégradées par la voie endolysosomale, et la majorité est stockée intracellulairement à la place et recyclée dans le rhabdomere lors de l’adaptation sombre6. TRPL peut ainsi être utilisé pour analyser le trafic déclenché par la lumière des protéines de la membrane plasmique. Les cellules photoréceptrices de la drosophile sont également utilisées pour étudier la dégénérescence neuronale. La dégénérescence des cellules photoréceptrices est souvent déterminée en évaluant la structure des rhabdomeres, qui se désintègrent à la suite de processus dégénératifs5.
Afin d’étudier la localisation subcellulaire de la TRPL et de la rhodopsine dans les cellules photoréceptrices ou la dégénérescence des cellules photoréceptrices, deux méthodes de microscopie à fluorescence qui diffèrent en termes de vitesse d’analyse et de résolution ont été appliquées ici. Une méthode très rapide et non invasive qui peut être utilisée pour les criblages génétiques mais avec une résolution spatiale limitée est la détection de fluorescence dans le pseudopieux profond (DPP). Le DPP est un phénomène optique d’yeux composés d’arthropodes dont l’origine géométrique a été expliquée en détail par Franceschini et Kirschfeld en 197111. En bref, sur plusieurs plans optiques sous la superposition de la rétine, des images de rhabdomeres d’ommatidies adjacentes peuvent être observées. Sur un plan focal passant par le centre de la courbure de l’œil, ces projections superposées forment une image qui ressemble à la disposition trapézoïdale des rhabdomeres dans un seul ommatidium seulement des ordres de grandeur plus grands. Ce phénomène peut également être observé indépendamment de l’expression exogène des protéines de fluorescence (par exemple TRPL::eGFP8), ce qui rend néanmoins le DPP plus facile à détecter (Figure 1A-A'')12. Une deuxième méthode non invasive est la microscopie par immersion dans l’eau qui repose sur l’imagerie de protéines marquées par fluorescence après avoir neutralisé optiquement l’appareil dioptrique des yeux avec de l’eau (Figure 1B-C'')12. En utilisant la méthode d’immersion dans l’eau, la quantité relative de TRPL::eGFP dans les rhabdomeres ou le corps cellulaire peut être évaluée quantitativement pour les cellules photoréceptrices individuelles. En outre, les protéines marquées par fluorescence non translocalisantes peuvent être utilisées pour évaluer l’intégrité rhabdomerale et pour déterminer l’évolution temporelle d’une dégénérescence potentielle de manière quantitative, comme décrit ici.
Bien que les enregistrements du DPP soient de loin les plus faciles et les plus rapides de ces méthodes, la résolution spatiale des données qu’ils génèrent est limitée. En outre, il existe de nombreuses raisons pour lesquelles un DPP peut être absent, qui ne sont pas nécessairement discernables par l’imagerie DPP elle-même. Étant donné que le DPP représente une somme de plusieurs ommatidies, des informations sur les cellules individuelles sont perdues. Ainsi, l’imagerie DPP à basse résolution joue un rôle important dans le dépistage d’un grand nombre de mouches, mais devrait généralement être suivie d’enregistrements à plus haute résolution par microscopie à immersion dans l’eau. Les micrographies à immersion dans l’eau permettent des interprétations sur les cellules individuelles, les défauts de développement, la morphologie des yeux, la mauvaise localisation des protéines ou la dégénérescence rétinienne ainsi que la quantification de ces effets. Le présent Protocole décrit ces deux techniques en détail.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figure 1 : Aperçu des variations microscopiques de l’œil de drosophile présentées dans ce protocole. Représentations schématiques et micrographies exemplaires de l’imagerie fluorescente par pseudopieux profond (DPP) (A-A''), de la microscopie par immersion dans l’eau létale (B-B'') des rhabdomeres fluorescents et de la microscopie à goutte d’eau non létale (C-C'') des rhabdomeres fluorescents. Barre d’échelle (A''): 100 μm. Barres d’échelle (B''-C''): 10 μm. La figure a été modifiée par rapport à la référence13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 coussin anti-mouches d’anesthésie</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Lampe à lumière froide (KL 1500 LCD)</td><td>Microscope à fluorescence Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec lampe UV, caméra, kit de filtres et logiciel (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue édition)</td>Tube fluorescent <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro ; W cm-2, Ee590nm = 215 &micro ; W cm-2] et [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro ; W cm-2, Ee590nm = 147 &micro ; W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de laboratoire (20-200 &micro ; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Object slide</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (200 &micro ; L)</td><td>Microscope</td><td>7695844</td><td></td></tr> absolu <tr><td>(Blu-Tack)</td><td>Stéréomicroscope Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>(SMZ445)</td><td></td>Stéréomicroscope Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>avec lampe UV, appareil photo, kit de dépôt et logiciel (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées egfp

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Le trafic de protéines membranaires régule l’incorporation et l’élimination des récepteurs et des canaux ioniques dans la membrane plasmique. Ce processus est fondamentalement important pour la fonction cellulaire et l’intégrité cellulaire des neurones. Les cellules photoréceptrices de la drosophile sont devenues un modèle pour l’étude du trafic de protéines membranaires. Outre la rhodopsine, qui, lors de l’illumination, s’intériorise à partir de la membrane photoréceptrice et se dégrade, le canal ionique de type récepteur transitoire (TRPL) chez la drosophile présente une translocation dépendante de la lumière entre la membrane photoréceptrice rhabdomerale (où elle est située dans l’obscurité) et le corps cellulaire photorécepteur (vers lequel elle est transportée lors de l’illumination). Ce transport intracellulaire de TRPL peut être étudié de manière simple et non invasive en exprimant le TRPL marqué eGFP dans les cellules photoréceptrices. La fluorescence eGFP peut alors être observée soit dans le pseudopoche profond, soit par microscopie à immersion dans l’eau. Ces méthodes permettent la détection de la fluorescence dans l’œil intact et sont donc utiles pour les tests à haut débit et les criblages génétiques de mutants drosophiles défectueux dans la translocation TRPL. Ici, la préparation des mouches, les techniques microscopiques, ainsi que les méthodes de quantification utilisées pour étudier cette translocation déclenchée par la lumière de TRPL sont expliquées en détail. Ces méthodes peuvent également être appliquées pour des études de trafic sur d’autres protéines photoréceptrices de la drosophile , par exemple la rhodopsine. De plus, en utilisant des protéines rhabdomeral marquées eGFP, ces méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la dégénérescence des cellules photoréceptrices.

Des mouches drosophiles transgéniques exprimant une protéine de fusion TRPL::eGFP sous le contrôle du promoteur de la rhodopsine 1 ont été générées. Chez ces mouches, TRPL::eGFP est exprimé dans les cellules photoréceptrices R1-6 de l’œil composé et affiche une localisation dépendante de l’éclairage. Lorsque les mouches sont maintenues dans l’obscurité, TRPL::eGFP est incorporé dans les rhabdomeres extérieurs. Après un éclairage de plusieurs heures, le TRPL se transloque dans le corps cellulaire où il est stocké...

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Les protéines photoréceptrices marquées GFP, comme le canal ionique TRPL GFP, nous permettent d’étudier le transport des protéines dans les neurones en utilisant des techniques non invasives. Cette méthode peut également être utilisée pour surveiller la dégénérescence des photorécepteurs. Ainsi, la base moléculaire des maladies héréditaires entraînant la cécité chez l’homme peut être étudiée dans l’œil de la drosophile.La localisation cellulaire des protéines marquées GFP peut être évaluée en observant la fluorescence dans le pseudopagoule profond ou par microscopie à immersion dans l’eau. Les deux méthodes permettent de déterminer rapidement la localisation des protéines visuelles et d’observer les défauts structurels des rhabdomeres dus à la dégénérescence des cellules photoréceptrices. Pour obtenir des images de haute qualité, l’aspect le plus important est l’orientation de l’œil de mouche.Lors de l’exécution de cette technique, il faut se concentrer sur les ommatidies situées légèrement vers la périphérie de l’œil. Je ferai la démonstration de la procédure d’imagerie DPP, tandis que les deux techniques utilisant la microscopie à immersion dans l’eau seront démontrées par ma collègue, la Dre Krystina Wagner, et Matthias Zeger, un étudiant au doctorat de notre groupe. Pour commencer l’imagerie de pseudopupile profond, ou DPP, anesthésiez des mouches âgées d’un à trois jours et positionnez l’une d’entre elles au centre de l’objectif du microscope sur le côté afin que l’œil gauche ou droit soit orienté vers l’objectif avec précision radialement.Augmentez le grossissement pour l’adapter à l’ensemble de l’œil et centrez les ommatidies centrales de l’œil. Si possible, diminuez la profondeur de champ du microscope en ajustant le diaphragme à double iris à un réglage peu profond. Ensuite, allumez la lampe UV du microscope à l’intensité maximale.Ensuite, sélectionnez l’ensemble de filtres de fluorescence du microscope en fonction de la protéine de fluorescence exprimée dans les yeux et définissez le chemin de la lumière vers la caméra montée au microscope. À l’aide de la fonction d’imagerie en direct du logiciel, ajustez la luminosité de l’image à un réglage qui détecte uniquement les signaux spécifiques de l’œil en augmentant le temps d’exposition et en gagnant de la valeur. Réajustez la mise au point du microscope dans l’œil pour générer l’image superposée du DPP.Ensuite, prenez un instantané du DPP fluorescent. Pour préparer une mouche dans une variante létale, collez un morceau de pâte à modeler sur une glissière d’objet et une autre pièce au centre d’une boîte de Pétri. Remplissez la boîte de Pétri avec de l’eau distillée glacée et des flocons de glace.Ensuite, placez une mouche anesthésiée par la glace sous un stéréomicroscope au-dessus de la lame d’objet recouverte de plasticine. Tournez la mouche sur le dos et percez une épingle à insectes au centre du thorax. Fixez la broche horizontalement sur la glissière d’objet recouverte de pâte à modeler et orientez l’œil gauche ou droit de la mouche vers le haut.Ensuite, fixez soigneusement la glissière de l’objet avec son côté sans pâte à modeler tourné vers le bas dans la boîte de Pétri, empêchant ainsi la rotation de la tête de mouche. Assurez-vous que l’œil de la mouche est recouvert d’eau. Alternativement, pour préparer une mouche dans une variation non létale, transférez la mouche anesthésiée par la glace la tête la première dans une pointe de pipette de 200 microlitres et poussez soigneusement la mouche vers la pointe avec de l’air comprimé.Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez la pointe de la pipette juste devant la tête et, à l’aide d’une pince à épiler, poussez soigneusement la mouche de quelques millimètres dans la pointe de la pipette. Coupez à nouveau l’extrémité de la pipette et repoussez la mouche vers la pointe avec l’air comprimé de sorte que seule la tête de la mouche dépasse de la pointe de la pipette. Après avoir collé un morceau de pâte à modeler sur une glissière d’objet, appuyez sur la pointe de la pipette de manière à ce que l’œil gauche ou droit soit tourné vers le haut.Assurez-vous que l’œil est correctement orienté au microscope. Pour l’acquisition d’images, sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau. Dans le cas d’une variation non létale, utilisez une pipette de laboratoire pour faire adhérer une grande goutte d’eau glacée sur la face inférieure de l’objectif d’immersion dans l’eau.Placez soigneusement la lame de l’objet avec la mouche préparée sur la scène du microscope. Ensuite, abaissez manuellement l’objectif d’immersion dans l’eau jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la surface de l’eau ou que l’œil de la mouche touche la goutte. Ensuite, basculez le chemin de la lumière vers la caméra du microscope et générez une image en direct.Réajustez la mise au point de l’appareil photo et évaluez l’orientation de l’œil, en considérant que l’œil doit faire face radialement à l’objectif du microscope. Utilisez le logiciel de table de choix pour détecter la sursaturation. Dans le cas des mouches non pigmentées, ajustez le temps d’exposition de manière à ce que les pixels les plus brillants soient juste en dessous de la limite de saturation pour chaque image.Enregistrez une image et enregistrez-la en tant que fichier brut pour archiver toutes les métadonnées correspondantes de l’enregistrement. Ensuite, exportez l’image dans un format tif. Pour quantifier la fluorescence eGFP relative dans les rhabdomeres des micrographies à immersion dans l’eau, ajustez les paramètres ImageJ en cliquant sur Analyser, puis sur Définir les mesures, et cochez uniquement la case Valeur grise moyenne.Importez l’image tif en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Choisissez une région représentative de l’image mise au point et agrandissez-la de 200 à 300 % en appuyant plusieurs fois sur Ctrl et ensemble. Ensuite, sélectionnez l’outil Ovale et, tout en appuyant sur la touche Maj, générez une sélection circulaire dans l’image qui est nettement plus petite qu’un rhabdomere fluorescent.Ensuite, recherchez la taille exacte affichée sous la barre d’outils dans la fenêtre principale d’ImageJ. Pour mesurer les intensités de fluorescence dans la sélection circulaire, déplacez le cercle vers le premier rhabdomere avec les touches fléchées du clavier, puis cliquez sur Analyser, puis sur Mesurer. Une fenêtre de résultats répertoriant la valeur grise mesurée apparaîtra.Continuez avec des mesures de rhabdomeres deux à six, et mesurez également le signal de fond. Dans le cas des mouches non pigmentées, effectuez des mesures supplémentaires des zones du corps cellulaire correspondantes. Mesurez la fluorescence de deux autres ommatidies, ce qui donne trois répliques techniques.Marquez les ommatidies analysées à l’aide de l’outil Crayon et enregistrez cette image pour la documentation. Sélectionnez et copiez les valeurs de gris mesurées dans la fenêtre de résultats, puis collez-les dans un tableur pour d’autres calculs. Triez les valeurs d’intensité de fluorescence en fonction de leur origine dans les catégories rhabdomere, corps cellulaire et arrière-plan, et calculez l’intensité moyenne de chaque catégorie.Ensuite, calculez la quantité relative d’eGFP présente dans le rhabdomere en utilisant la première formule pour les yeux non pigmentés et la seconde pour les yeux pigmentés. Alternativement, pour quantifier la morphologie des yeux par fluorescence eGFP dans des micrographies à immersion dans l’eau, choisissez trois ommatidies adjacentes dans une région représentative de l’image qui est mise au point. Évaluez individuellement les 18 rhabdomeres de la sélection en fonction de leur intensité eGFP, de leur netteté des bords et de leur contraste par rapport au signal de fond environnant.Enfin, notez les rhabdomeres clairement visibles avec une valeur de deux, les rhabdomeres visibles hebdomadaires avec une valeur de un, et les rhabdomeres absents avec une valeur de zéro pour générer un indice de dégénérescence. Chez les mouches transgéniques de la drosophile exprimant une protéine de fusion eGFP TRPL, la fluorescence rhabdomerale disparaît à la lumière en raison de la translocation de l’eGFP TRPL. Cela permet d’effectuer un criblage génétique pour identifier les mutants défectueux dans l’internalisation de l’eGFP TRPL.Chez les mouches témoins, eGFP TRPL se transloque hors des rhabdomeres dans le corps cellulaire après 16 heures d’éclairage, ce qui entraîne une diminution significative de la fluorescence rhabdomerale par rapport à l’état adapté à l’obscurité. La deuxième incubation sombre élève à nouveau la fluorescence rhabdomerale vers la valeur initiale. Cependant, dans la translocation TRPL défectueuse mutant vps35MH20, le schéma de fluorescence ne change pas radicalement après 16 heures d’éclairage et une adaptation ultérieure à l’obscurité pendant 24 heures.Cette méthode de quantification permet de détecter un défaut de recyclage statistiquement très significatif. Les mouches aux yeux blancs permettent la détection de signaux de fluorescence provenant à la fois du rhabdomere et du corps cellulaire. En revanche, chez les mouches aux yeux rouges, les signaux de fluorescence ne sont détectables que dans les rhabdomeres mais pas dans le corps cellulaire.En ce qui concerne la quantification de la dégénérescence rétinienne, la fluorescence eGFP TRP peut être évaluée sur plusieurs semaines. Lorsqu’il est maintenu dans un cycle d’obscurité de 12 heures et de 12 heures pendant deux semaines, l’indice de dégénérescence diminue chez les mouches mutantes, mais pas chez les mouches témoins. Dans ce protocole, il faut faire la différence entre les yeux pigmentés et non pigmentés.Étant donné que la pigmentation affecte le signal fluorescent, la microscopie quantitative à immersion dans l’eau a été optimisée pour les deux cas individuellement. L’imagerie DPP et la microscopie à immersion dans l’eau sont des méthodes à haut débit avec une résolution limitée. Pour étudier la localisation subcellulaire, nous recommandons la microscopie par immunofluorescence sur les coupes de tissus.Pour une analyse détaillée des phénotypes dégénératifs, une microscopie électronique peut être effectuée.

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Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP (Vidéo) | JoVE Journal

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