Name: Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez une méthode pour quantifier le transport du fer placentaire chez la souris grâce à des isotopes stables non radioactifs. Cette technique permet d'étudier la distribution du fer materno-fœtal en toute sécurité.

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Les auteurs reconnaissent l’utilisation de l’installation ICP-MS au sein du UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology au CNSI de l’UCLA pour leur aide à optimiser le protocole pour les mesures de 58Fe. L’étude a été soutenue par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (K01DK127004, à VS) et l’Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) des NIH (R01HD096863, à EN).

Tous les protocoles et procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à Los Angeles.
1. Préparation du 58Fe-Tf
REMARQUE: Le protocole utilise 58Fe; cependant, un protocole identique peut être utilisé pour 57Fe. L’un ou l’autre isotope peut être utilisé et éliminé comme produit chimique de fer standard sans précautions supplémentaires.
<ol><li>Dissoudre 58 Fe dans 12 N HCl à 50 μL de HCl/mg de 58Fe.<ol><li>Ajouter du HCl au métal dans le flacon en verre fourni par le vendeur et remplacez le bouchon lâchement. Pour dissoudre le fer, chauffer la solution 58Fe/HCl à 60 °C pendant 1 h. Si elle n’est toujours pas dissoute, laisser la solution toute la nuit à température ambiante dans la hotte pour la dissoudre. NOTE: La solution dissoute de 58Fe / HCl est de couleur orange jaunâtre. Fe3O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O</li>
	</ol></li>
	<li>Oxyder tout Fe(II)Cl2restant pour générer la solution de Fe(III)Cl3.<ol><li>Réchauffer la solution de 58Fe/HCl à 60 °C avec le bouchon enlevé pour faciliter l’oxydation.</li>
		<li>Ajouter 1 μL de solution à 35 %H2O2par 50 μL de solution 58Fe/HCl pour faciliter davantage l’oxydation. Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) +2H2O</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer la solution de chlorure ferrique (58Fe(III)Cl3).<ol><li>Laisser la solution de chlorure ferrique dans la hotte à 60 °C avec le bouchon enlevé pour évaporer l’échantillon. NOTE: L’évaporation peut prendre entre un et plusieurs jours.</li>
		<li>Reconstituer 58 Fe(III)Cl3 à 100 mM avec du H2O ultrapur, et calculer la quantité de H2O ultrapure requise en fonction du poids initial du métal utilisé à l’étape 1.1 (poids moléculaire de 58Fe(III)Cl3 est de 162,2).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le 58 Fe(III)-nitrilotriacétate (NTA) en incubant le 58Fe(III)Cl3 avec du NTA à un rapport molaire de 1:5 en présence de 20 mM de NaHCO3.<ol><li>Préparer 500 mM NTA dans 1 N NaOH.</li>
		<li>Préparer 5x tampon de chargement de transferrine (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).</li>
		<li>Préparer 1 M deNaHCO3 enH2Oultrapur.</li>
		<li>Dans un tube conique de 15 mL, ajouter 150 μL de solution de 100 mM de 58 Fe(III)Cl3 (à partir de l’étape 1.3.2), 150 μL de NTA 500 mM préparé dans 1 N NaOH, 480 μL deH2Oultrapur, 200 μL de tampon de charge de transferrine 5xet 20 μL de solution de NaHCO3 1 M.</li>
		<li>Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Charger apo-Tf avec 58 Fe(III)-NTA pour former 58Fe-Tf. NOTE: Ce protocole a été adapté de McCarthy et Kosman28.<ol><li>Dissoudre 500 mg d’apo-Tf dans 4 mL de 1x tampon de chargement Tf.</li>
		<li>Dans le tube conique de 15 mL de l’étape 1.4.4 contenant 1 mL de la solution de 58Fe(III)-NTA, ajouter 4 mL de solution d’apo-Tf. NOTE: Il s’agit d’un rapport molaire 3: 1 de 58Fe-NTA avec apo-Tf. Chaque Tf contient 2 sites de liaison Fe; l’excédent de 58Fe-NTA a été ajouté pour s’assurer que le Tf était complètement chargé.</li>
		<li>Pour permettre une charge maximale de 58Fe-NTA sur apo-Tf, vérifier que la solution est à pH 7,5 et ajuster le pH, si nécessaire, avec NaHCO3 ou HCl.</li>
		<li>Incuber pendant 2,5 h à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirer l’excès de 58Fe(III)-NTA non consolidé et le NTA libéré.<ol><li>Transférer la solution 58Fe-Tf dans une colonne de coupure de poids moléculaire (coupure de 30 kDa) et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver la colonne avec 10 mL de 1x tampon de chargement de transferrine et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 min à température ambiante. Répéter le lavage et la centrifugation, effectuer un lavage au sérum physiologique avec 10 ml de solution saline et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 minutes à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Calculer la concentration de 58Fe-Tf. NOTE: En raison de l’ajout de l’excès de 58Fe à l’étape 1.5.2, supposons que toute la transferrine est diferrique. Comme 500 mg d’apo-Tf ont été utilisés, ~500 mg 58Fe-Tf ont été produits à l’étape 1.5.4.<ol><li>Mesurer le volume récupéré par centrifugation après le lavage au sérum physiologique à l’étape 1.6.2.</li>
		<li>Diviser 500 mg par le volume récupéré pour déterminer la concentration (en mg/mL) de la solution de 58Fe-Tf.</li>
	</ol></li>
	<li>Stériliser la solution 58Fe-Tf à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm; conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. NOTE: La solution de 58Fe-Tf a été utilisée entre 1 et 4 semaines après la préparation.</li>
</ol>2. Configurez des grossesses de souris chronométrées
<ol><li>Utilisez des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines. Placez les animaux sur un régime pauvre en fer (4 ppm de fer) ou un chow standard (185 ppm de fer) pendant 2 semaines avant l’accouplement et maintenez les animaux sur les régimes respectifs tout au long de la grossesse.</li>
	<li>Option 01: Confirmer la grossesse par prise de poids à E7.5.<ol><li>Installez plusieurs cages d’élevage. Pour chaque cage, combiner 2 femelles avec 1 mâle pendant la nuit; le jour suivant, lorsque les animaux sont séparés, est considéré comme un jour embryonnaire (E)0,5. Peser les femelles à E7.5 pour déterminer si elles sont enceintes. Accouplez à nouveau les mâles avec les femelles qui n’ont pas pris de poids. REMARQUE: Dans WT C57BL / 6, un gain de poids de 1 g à E7.5 est un bon indicateur de grossesse. Cette méthode garantit que l’implantation a eu lieu dans un délai spécifique de 16 heures, permettant un traitement synchrone de tous les animaux qui sont devenus gravides au cours de la même période d’accouplement.</li>
	</ol></li>
	<li>Option 02: Confirmer la grossesse par des vérifications de bouchon.<ol><li>Combinez 2 femelles avec 1 mâle et effectuez des vérifications quotidiennes du bouchon pour déterminer si la copulation a eu lieu. REMARQUE: Cette méthode peut entraîner des grossesses décalées et la présence d’un bouchon ne garantit pas la grossesse.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Administrer 58Fe-Tf par voie intraveineuse à des souris gravides E17.5
<ol><li>Préparer 58Fe-Tf de l’étape 1.8 pour injection.<ol><li>Préparer une solution de 58Fe-Tf à 35 mg/mL dans une solution saline; injecter 100 μL par souris.</li>
		<li>Remplir une seringue à insuline avec 100 μL de la solution de 58Fe-Tf. REMARQUE : Chaque dose contient 3,5 mg de 58 Fe-Tf humain (5 μg de 58Fe).</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésier une souris enceinte à l’aide d’isoflurane.<ol><li>Utilisez un régulateur d’isoflurane avec une chambre.</li>
		<li>Utilisez les paramètres suivants : isoflurane à 5 %, 2 L/mL d’O2, 2 min.</li>
		<li>Confirmez que la souris est anesthésiée en recherchant l’absence de réponse à un pincement d’orteil.</li>
		<li>Appliquez du lubrifiant pour les yeux à la surface de l’œil et placez la souris sur un coussin chauffant.</li>
	</ol></li>
	<li>Injectez lentement et prudemment la solution de 58Fe-Tf dans le sinus rétro-orbitaire.</li>
	<li>Permettre à la souris de récupérer de l’anesthésie; Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.</li>
	<li>Six heures après l’injection, euthanasier les femelles enceintes E17.5 par surdose d’isoflurane.<ol><li>Effectuer une ponction cardiaque pour exsanguiner la souris comme une forme d’euthanasie secondaire.</li>
		<li>Épinglez les pieds avec des aiguilles pour la stabilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Recueillir les placentas et les foies d’embryons.<ol><li>À l’aide de forceps stériles et de ciseaux à dissection, retirez soigneusement l’utérus de la souris enceinte. Coupez une unité placentaire fœtale-placentaire, qui comprend un seul fœtus et placenta dans le sac amniotique entouré d’une partie de l’utérus.</li>
		<li>Coupez soigneusement à travers l’utérus et le sac amniotique sans déranger le fœtus et le placenta.</li>
		<li>Décollez le sac amniotique et retirez le fœtus et le placenta.</li>
		<li>Coupez le cordon ombilical.</li>
		<li>Épongez le fœtus et le placenta sur une lingette propre pour éliminer l’excès de liquide amniotique.</li>
		<li>Notez les poids de l’ensemble du placentae.</li>
		<li>Couper chaque placenta en deux avec une lame de rasoir, placer chaque moitié dans un tube de 2,0 ml et congeler dans de l’azote liquide. REMARQUE : Étant donné que le 58 Fe ne nécessite pas de précautions particulières de manipulation et d’élimination, la moitié du placenta peut être utilisée pour la mesure du 58Fe et l’autre moitié pour toute autre analyse, y compris la quantification de l’expression du récepteur de la transferrine (TFR1) et de la ferroportine (FPN) par transfert Western et qPCR.</li>
		<li>Pour prélever des foies d’embryons, sacrifiez l’embryon : utilisez une lame de rasoir pour décapiter rapidement l’embryon. REMARQUE : À E17.5, tous les embryons de l’utérus doivent être euthanasiés individuellement, même s’ils ne sont pas utilisés dans l’étude.</li>
		<li>Épinglez l’embryon pour la stabilisation, laissant l’abdomen exposé.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux à dissection, faites une petite incision à l’endroit où le cordon ombilical était attaché, insérez une extrémité des ciseaux de dissection dans l’incision et effectuez une coupe du plan médian vers le plan coronal d’environ 1/4 de pouce. Ensuite, effectuez des coupes transversales planes pour exposer le foie fœtal.</li>
		<li>Utilisez une pince pour enlever le foie du fœtus.</li>
		<li>Enregistrer le poids du foie embryonnaire entier.</li>
		<li>Placez les foies entiers de l’embryon dans des tubes de 2 ml et congelez-les dans de l’azote liquide. NOTE: Alternativement, seule une partie du foie de l’embryon peut être utilisée pour la mesure de 58Fe si des analyses supplémentaires sont souhaitées. L’utilisation de tubes de 2,0 mL permet une meilleure homogénéisation des tissus que les tubes de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservez les tissus indéfiniment à -80 °C.</li>
</ol>4. Tissus de traitement pour l’analyse quantitative du fer par ICP-MS
<ol><li>Traiter les placentas et les foies fœtaux pour la quantification du fer non hémique.
	<ol><li>Décongeler les moitiés placentaires et le foie fœtal entier, et peser les moitiés placentaires (voir l’étape 3.6.12 pour l’enregistrement du poids du foie du fœtus).</li>
		<li>Ajouter 400 μL de solution de précipitation protéique (0,53 N HCl, 5,3% TCA).</li>
		<li>Homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur électrique.</li>
		<li>Incuber les échantillons à 100 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Refroidir les échantillons dans de l’eau à température ambiante pendant 2 min.</li>
		<li>Ouvrez les bouchons pour relâcher la pression, puis refermez les tubes.</li>
		<li>Centrifuger à 17 000 × g pendant 10 min à température ambiante pour pelleter les débris tissulaires.</li>
		<li>Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube étiqueté.</li>
		<li>Envoyez des échantillons pour analyse ICP-MS.</li>
	</ol></li>
	<li>Traiter les placentas et les foies fœtaux pour la quantification de l’hème-fer. NOTE: Après extraction du fer non hémique à l’étape 1, le fer restant dans la pastille est principalement de l’hème.<ol><li>Noter le poids de chaque pastille à partir de l’étape 4.1.7.</li>
		<li>Digérer les granulés dans 10 mL de HNO3 concentré à 70 % complété par 1 mL de 30 %H2O2 NOTE: Consulter le noyau ou le centre ICP-MS pour optimiser le volume de HNO3 pour des études spécifiques; Le volume dépendra en partie du poids de l’échantillon.</li>
		<li>Chauffer les échantillons à 200 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Envoyez les échantillons pour analyse ICP-MS. REMARQUE: Si la distinction entre les sources de fer hémique et non hémique n’est pas nécessaire et que seul le fer total est mesuré, le tissu entier peut être digéré dans HNO3 comme première étape.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse des données
NOTA: Les données de la PIC-SM ont été fournies à des concentrations de 56Fe et 58Fe en ng/mL ou en mg, ppb (tableau 1). 56 Fe est l’isotope de fer le plus abondant dans la nature, et sa mesure reflète l’accumulation de fer dans le placenta / embryon pendant toute la grossesse, tandis que la mesure 58Fe reflète le fer qui a été transféré pendant 6 heures après l’injection.
<ol><li>Soustrayez l’abondance naturelle de 58 Fe (0,28 % du Fe total) des valeurs mesurées de 58Fe.</li>
	<li>Calculer le nonhème total 58Fe.<ol><li>Calculer le fer non hémique (ng) total du foie embryonnaire en multipliant d’abord la concentration en fer (ng/mL) calculée à l’étape 5.1 par le volume (mL) lors du traitement initial à l’étape 4.1.2 pour estimer le total 58Fe.</li>
		<li>Calculer la quantité de fer dans l’ensemble du placenta en prenant le poids total du placenta mesuré à l’étape 3.6.6 et en le divisant par le poids du placenta traité à l’étape 4.1.1. Multiplier cette valeur par le fer non hémique total (ng) calculé à l’étape 5.2.1 pour obtenir la teneur totale en 58Fe non hémique du placenta.</li>
	</ol></li>
	<li>Calculer l’hème total 58Fe.<ol><li>Calculer l’hème total 58Fe en multipliant d’abord la concentration en fer (ng/mg) calculée à l’étape 5.1 par le poids de la pastille (en mg) mesurée à l’étape 4.2.1.</li>
		<li>Ensuite, divisez le poids total du placenta mesuré à l’étape 3.5.1 par le poids de la pastille de placenta mesurée à l’étape 4.2.1. Multiplier cette valeur par le fer hémique total (ng) calculé à l’étape 5.3.1 pour obtenir la teneur totale en hème 58Fe du placenta.</li>
	</ol></li>
	<li>Additionner les valeurs calculées de nonhème et d’hème 58Fe pour déterminer la teneur totale en fer de chaque tissu.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63378/63378fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé visuel des étapes du protocole. (A) Préparation de 58Fe-transferrin. (B) Administration in vivo de 58Fe-transferrine. C) Collecte et stockage des tissus. D) Traitement du placenta et du foie embryonnaire pour la quantification des espèces métalliques par ICP-MS. Abréviations : Fe = fer; NTA = acide nitrilotriacétique; Tf = transferrine; PPS = solution de précipitation protéique; Sup = surnageant; TCA = acide trichloracétique; ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63378/63378fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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</ol>

EN est co-fondateur scientifique d’Intrinsic LifeSciences et de Silarus Pharma et consultant pour Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics et Disc Medicine. VS ne déclare aucun conflit.

Le fer est important pour de nombreux processus biologiques, et son mouvement et sa distribution dans le corps sont très dynamiques et régulés. Les isotopes stables du fer offrent une alternative cohérente et pratique aux isotopes radioactifs pour l’évaluation de la dynamique de l’homéostasie du fer. Une étape critique du protocole consiste à garder une trace de tous les poids et volumes des tissus. Le fer est un élément et ne peut donc pas être synthétisé ni décomposé. Ainsi, si tous les poids et volumes sont soigneusem...

Le fer est essentiel à divers processus métaboliques, notamment la croissance et le développement, la production d’énergie et le transport de l’oxygène1. Le maintien de l’homéostasie du fer est un processus dynamique et coordonné. Le fer est absorbé par les aliments dans le duodénum et transporté dans tout le corps dans la circulation liée à la protéine de transport du fer transferrine (Tf). Il est utilisé par chaque cellule pour les processus enzymatiques, incorporé dans l’hémoglobine dans les érythrocytes naissants et recyclé à partir d’érythrocytes âgés par les macrophages. Le fer est stocké dans le foie lorsqu’il est en excès et perdu du corps par hémorragie ou desquamation cellulaire. La quantité de fer en circulation est le résultat de l’équilibre entre la consommation et l’apport de fer, ce dernier étant étroitement régulé par l’hormone hépatique hepcidine (HAMP), le régulateur central de l’homéostasie du fer1. L’hepcidine a pour fonction de limiter la biodisponibilité du fer dans le sang en occlusant ou en induisant une ubiquitination et en dégradant la ferroportine exportatrice de fer (FPN)2. La réduction de la NPF fonctionnelle entraîne une diminution de l’absorption alimentaire du fer, une séquestration du fer dans le foie et une diminution du recyclage du fer des macrophages1.
L’hepcidine est régulée par le statut en fer, l’inflammation, la pulsion érythropoïétique et la grossesse (revue dans 3). Étant donné que l’homéostasie du fer est très dynamique, il est important de comprendre et de mesurer le pool total de fer et la distribution et le renouvellement du fer. Les études animales reposaient traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde pour mesurer la dynamique du fer. Cependant, dans des études plus récentes, y compris l’étude présentée ici4, des isotopes de fer stables non radioactifs (58Fe) sont utilisés pour mesurer le transport du fer pendant la grossesse 5,6,7,8,9. Les isotopes stables sont des outils précieux pour étudier le métabolisme des nutriments (examiné dans 10). L’utilisation d’isotopes stables du fer dans les études humaines a démontré que i) l’absorption du fer augmente vers la fin de la gestation5,6, ii) le transfert de fer alimentaire au fœtus dépend du statut en fer de la mère7, iii) le fer hémique ingéré par la mère est plus facilement incorporé par le fœtus que le fer non hémique 8, et iv) le transfert de fer au fœtus est négativement corrélé avec les taux d’hepcidine maternelle 8, 9. Ces expériences ont mesuré les isotopes du fer dans les sérums ou leur incorporation dans les globules rouges; cependant, la mesure du fer incorporé dans les globules rouges peut à elle seule sous-estimer l’absorption réelledu fer 9. Dans la présente étude, le fer hémique et non hémique est mesuré dans les tissus.
Pendant la grossesse, le fer est nécessaire pour soutenir l’expansion du volume de globules rouges maternels et pour le transfert à travers le placenta pour soutenir la croissance et le développement du fœtus11. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transport du fer à travers le placenta. Au cours de la grossesse chez l’homme 12 et le rongeur 4,13, les taux d’hepcidine diminuent considérablement, augmentant la disponibilité plasmatique du fer pour le transfert au fœtus.
Les principes fondamentaux du transport placentaire du fer ont été initialement caractérisés dans les années 1950-70 à l’aide de traceurs radioactifs (59Fe et 55Fe). Ces études ont déterminé que le transport du fer à travers le placenta est unidirectionnel 14,15 et que la transferrine diferrique est une source majeure de fer pour le placenta et le fœtus 16,17. La compréhension actuelle du transport du fer placentaire est plus complète, bien que certains transporteurs de fer clés et mécanismes de régulation restent inconnus. Les modèles murins ont été essentiels pour comprendre la régulation et le transportdu fer 18 parce que les principaux transporteurs et mécanismes sont remarquablement similaires. Les placentas humains et murins sont hémochorials, c’est-à-dire que le sang maternel est en contact direct avec le chorion fœtal19. Cependant, il existe des différences structurelles notables.
Le syncytiotrophoblaste est la couche cellulaire placentaire qui sépare la circulation maternelle et fœtale et transporte activement le fer et d’autres nutriments20. Chez l’homme, le syncytiotrophoblaste est une seule couche de cellules fusionnées. En revanche, le placenta de souris est constitué de deux couches syncytiotrophoblastiques21, Syn-I et Syn-II. Cependant, des jonctions lacunaires à l’interface de Syn-I et Syn-II permettent la diffusion des nutriments entre les couches22,23. Ainsi, ces couches fonctionnent comme une seule couche syncytiale similaire au syncytiotrophoblaste humain. D’autres similitudes et différences entre les placentas humains et murins sont examinées par Rossant et Cross21. Le transport placentaire du fer est déclenché par la liaison du fer-Tf du sang maternel au récepteur de la transferrine (TfR1) localisé sur la face apicale du syncytiotrophoblaste24. Cette interaction induit l’internalisation du fer-Tf/TfR1 via l’endocytose médiée par la clathrine25. Le fer est ensuite libéré de Tf dans l’endosomeacide 26, réduit en fer ferreux par une ferrireductase indéterminée, et exporté de l’endosome vers le cytoplasme par un transporteur qui reste à déterminer. Comment le fer est chaperonné dans le syncytiotrophoblaste reste également à décrire. Le fer est finalement transporté du côté fœtal par l’exportateur de fer, FPN, localisé sur la surface basale ou fœtale du syncytiotrophoblaste (examiné dans27).
Pour comprendre comment la régulation physiologique et pathologique de TfR1, FPN et hepcidine affecte le transport placentaire du fer, des isotopes stables du fer ont été utilisés pour quantifier le transport du fer de la circulation maternelle au placenta et à l’embryon in vivo4. Cet article présente les méthodes de préparation et d’administration de la transférrine de fer isotopique à des souris gravides, le traitement des tissus pour la PCI-MS et le calcul des concentrations de fer dans les tissus. L’utilisation d’isotopes stables du fer in vivo peut être adaptée pour étudier la régulation et la distribution du fer dans différents modèles animaux afin d’étudier la régulation physiologique et pathologique du fer.

<table><tbody><tr><td>58Fe-fer métal</td><td>Trace Sciences International</td><td>Fe-58</td><td></td></tr><tr><td>Filtre centrifuge Amicon ultra-15, coupure 30 kDa</td> Tubes à centrifuger <td>Millipore Sigma</td><td>UFC903024</td><td></td></tr>, <tr><td>15 mL</td> Tubes à centrifuger <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>, 50 mL</td> Centrifugeuse <td>Millipore Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr>, <tr><td>Microcentrifugeuse Sorvall Legend Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002432</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse, Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essuie-glaces délicats</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Régime alimentaire : carence en fer (4 ppm de fer)</td><td>Envigo Teklad</td><td>TD.80396</td><td></td></tr><tr><td>Régime alimentaire : chow standard (fer 185 ppm)</td><td>PicoLab</td><td>5053</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection avec tranchant de</td> <td>30 mmVWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>Pince 4-1/2 pouce de longueur</td><td>McKesson</td><td>157-469</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur, Bio-Gen PRO200</td><td>PROScientific</td><td>01-01200</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrine humaine (apo-Tf)</td><td>Celliance</td><td>4452-01</td><td>n’est plus disponible, alternative : Millipore 616419</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2), solution à 35 % en poids dans l’eau</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88216-36</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline, BD Lo-Dose U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant métallique</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtube à centrifuger avec bouchon plat</td><td>à vis VWR</td><td>16466-064</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger 1,5 mL à faible rétention</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger 2,0 mL à faible rétention</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; m, polyéthersulfone, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrilotriacétique (NTA)</td><td>Sigma</td><td>72560-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 25 g x 5/8 po hypodermique à usage général</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes de pH, plastique pH5.0-9.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-519</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir 0,22 mm</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Échelle (g)</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>Balance (mg)</td><td>Mettler Toledo</td><td>Balance XS204</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile, embout coulissant (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-500</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

Le fer est essentiel pour la santé maternelle et fœtale pendant la grossesse, avec environ 1 g de fer nécessaire chez les humains pour maintenir une grossesse en santé. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transfert de fer à travers le placenta, et les perturbations de ce transfert peuvent entraîner des issues défavorables de la grossesse. Chez la souris, la mesure des flux de fer à travers le placenta reposait traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde. Les isotopes stables du fer (57Fe et 58Fe) offrent une alternative non radioactive pour les études sur la grossesse humaine.
Dans des conditions physiologiques, le fer lié à la transferrine est la forme prédominante de fer absorbée par le placenta. Ainsi, la 58Fe-transferrine a été préparée et injectée par voie intraveineuse chez des mères gravides afin d’évaluer directement le transport du fer placentaire et de contourner l’absorption intestinale du fer maternel en tant que variable confondante. Le fer isotopique a été quantifié dans le placenta et les tissus embryonnaires de souris par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Ces méthodes peuvent également être utilisées dans d’autres systèmes de physiologie ou de maladie de modèles animaux pour quantifier la dynamique du fer in vivo .

Une étude antérieure utilisant des isotopes de fer stables pour mesurer le transport du fer a démontré que la carence en fer maternelle entraînait la régulation négative de l’exportateur de fer placenta, FPN4. FPN est le seul exportateur de fer de mammifères connu, et l’absence de FPN pendant le développement entraîne la mort embryonnaire avant E9.529. Pour déterminer si la diminution observée de l’expression de FPN se traduisait fonctionnellement par une diminution du tran...

Cet article montre comment préparer et administrer du fer isotopique non radioactif lié à la transferrine pour des études sur le transport du fer chez la souris gravide. L’approche de quantification du fer isotopique dans les compartiments fœtoplacentaires est également décrite.

Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal ...

Ce protocole est important car il permet aux chercheurs de suivre et de quantifier la distribution du fer in vivo sans avoir besoin de radioactivité. Étant donné que plusieurs isotopes stables du fer peuvent être détectés simultanément dans le même échantillon, cette technique peut être utilisée pour comprendre l’absorption, la régulation et la distribution du fer provenant de différentes sources. Pour commencer, ajoutez 12 acides chlorhydriques normaux au fer 58 dans le flacon en verre fourni par le vendeur et remplacez le bouchon en vrac.Pour dissoudre le fer, réchauffez la solution à 60 degrés Celsius pendant une heure. Si elle n’est toujours pas dissoute, laisser la solution toute la nuit à température ambiante dans la hotte pour la dissoudre. Ensuite, pour générer la solution de chlorure ferrique, oxyder tout chlorure ferreux restant en réchauffant la solution à 60 degrés Celsius avec le bouchon éteint pour faciliter l’oxydation.Ajouter un microlitre de peroxyde d’hydrogène à 35% par 50 microlitres de solution pour faciliter davantage l’oxydation. Laissez la solution de chlorure ferrique dans la hotte à 60 degrés Celsius avec le bouchon enlevé pour évaporer l’échantillon. Reconstituez ensuite le chlorure ferrique à 100 millimoles avec de l’eau ultrapure.Calculez la quantité d’eau requise en fonction du poids initial du métal. Ensuite, préparez un millilitre de nitrilotriacétate ferrique en incubant la solution de chlorure ferrique préparée avec du nitrilotriacétate à un rapport molaire d’un à cinq en présence de 20 millimolaires de bicarbonate de sodium pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre 500 milligrammes d’apotransferrine dans quatre millilitres de tampon de transfert et de chargement, et ajouter quatre millilitres de cette solution d’apotransferrine à la solution de nitrilotriacétate ferrique préparée dans le tube de 15 millilitres.Pour permettre une charge maximale de nitrilotriacétate ferrique sur l’apotransferrine, vérifier que la solution est à pH 7,5 et ajuster le pH si nécessaire avec du bicarbonate de sodium ou de l’acide chlorhydrique. Incuber le mélange pendant 2 1/2 heures à température ambiante. Ensuite, retirez l’excès de nitrilotriacétate ferrique non lié et libérez le nitrilotriacétate en transférant la solution de transferrine de fer 58 sur une colonne de coupure de poids moléculaire et en centrifugeant la colonne.Après centrifugation, laver la colonne deux fois en ajoutant 10 millilitres de tampon de charge de transferrine et en centrifugeant la colonne. Ensuite, lavez la colonne avec 10 millilitres de solution saline et centrifugez à nouveau. Enfin, stérilisez la solution de transferrine de fer 58 à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.Préparer une solution de transferrine de fer 58 à 35 milligrammes par millilitre dans une solution saline. Ensuite, placez une souris enceinte anesthésiée sur un coussin chauffant et injectez lentement et soigneusement la solution de transferrine de fer 58 dans le sinus rétro-orbitaire. Six heures après l’injection, euthanasiez la souris et retirez soigneusement l’utérus à l’aide d’une pince stérile et de ciseaux à dissection.Couper une unité placentaire fœtale comprenant un seul fœtus et un placenta dans le sac amniotique entouré d’une partie de l’utérus. Ensuite, coupez soigneusement l’utérus et le sac amniotique sans déranger le fœtus et le placenta. Ensuite, retirez le sac amniotique et retirez le fœtus et le placenta.Après avoir coupé le cordon ombilical, épongez le fœtus et le placenta lors d’une lingette propre pour éliminer l’excès de liquide amniotique et notez le poids de l’ensemble du placenta. Coupez chaque placenta en deux avec une lame de rasoir. Placez chaque moitié dans un tube de deux millilitres et congelez dans de l’azote liquide.Pour recueillir les foies embryonnaires, sacrifiez l’embryon et épinglez l’embryon pour la stabilisation en laissant l’abdomen exposé. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une petite incision à l’endroit où le cordon ombilical était attaché. Insérez une extrémité du ciseau de dissection dans l’incision et effectuez une coupe du plan médian de 1/4 de pouce vers le plan coronal.Ensuite, effectuez des coupes transversales planes pour exposer le foie fœtal. À l’aide de forceps, retirez le foie fœtal et notez le poids de l’ensemble du foie embryonnaire. Placez le foie de l’embryon entier dans un tube de deux millilitres et congelez-le dans de l’azote liquide.Conservez les mouchoirs indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour quantifier le fer non hémique dans le placenta et le foie fœtal, décongelez les moitiés placentaires et les foies fœtaux entiers. Pesez ensuite les moitiés placentaires.Ajouter 400 microlitres de solution de précipitation protéique aux échantillons de tissus et homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur électrique. Incuber les échantillons à 100 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, refroidissez-les à température ambiante pendant deux minutes.Ouvrez les bouchons pour relâcher la pression. Puis fermez à nouveau les tubes. Après avoir centrifugé l’échantillon pour granuler les débris tissulaires, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube marqué pour l’analyse ICP-MS.Ensuite, pour quantifier le fer hémique, notez le poids de la pastille obtenue après centrifugation. Digérez ensuite les granulés dans 10 millilitres d’acide nitrique concentré à 70%, complété par un millilitre de peroxyde d’hydrogène à 30%. Chauffer les échantillons à 200 degrés Celsius pendant 15 minutes avant de les envoyer pour analyse ICP-MS.La mesure ICP-MS a permis la détection de deux isotopes de fer différents. L’isotope du fer le plus abondant, le fer 56, reflète les changements ioniques chroniques dans les tissus. Un autre isotope, le fer 58, reflète des changements aigus dans la distribution du fer injecté.La mesure du fer 56 a confirmé que les foies d’embryons issus de grossesses déficientes en fer avaient diminué les réserves de fer par rapport à ceux des grossesses remplies de fer. La mesure du fer 58 a confirmé que dans les grossesses déficientes en fer, moins de fer a été transféré au foie embryonnaire en six heures que dans les grossesses remplies de fer. Lors de l’exécution de la procédure, n’oubliez pas d’enregistrer le poids des tissus.Ces poids sont nécessaires pour calculer les concentrations de fer. Étant donné que le fer 58 ne nécessite pas de précautions particulières de manipulation et d’élimination, les tissus non transformés peuvent être utilisés pour d’autres analyses, y compris, mais sans s’y limiter, le transfert Western ou qPCR.

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Nous avons développé une nouvelle approche chirurgicale pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs dans le fœtus de souris. L'itinéraire de livraison est plus efficace en ciblant les poumons de foetus de souris que l'couramment utilisés injection intra-amniotique. Cette procédure n'a jusqu'à présent pas été décrits dans un modèle de souris.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode colorimétrique pour déterminer la teneur en fer non héminique dans le tissu hépatique de souris. Le sulfonate de bathophénanthroline est utilisé comme substrat chromogène en présence d’un agent réducteur, qui convertit le fer ferrique en fer ferreux chélatable.

Dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline sulfonate : une méthode simple et rapide pour la quantification du fer non héminique dans le tissu hépatique de souris

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Nous présentons une méthode détaillée pour étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme. La méthode combine l'échantillonnage du sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta avec des mesures ultrasonores du flux sanguin volumique et de l'échantillonnage du tissu placentaire.

L&#39;approche d&#39;échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain<em&gt; In vivo</em

Les auteurs décrivent un système qui utilise trois méthodes pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de l’administration de médicaments ciblés placenta : in vivo de l’imagerie pour surveiller l’accumulation de nanoparticules, échographie de haute fréquence pour surveiller le développement placentaire et foetal et de la CLHP pour quantifier les medicaments au tissu.

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On présente ici un protocole de perfusion vasculaire fœtale ex vivo pour permettre l’administration d’un article d’essai dans la vascularisation maternelle et pour évaluer le transfert placentaire de particules xénobiotiques ou d’agents pharmacologiques en plus des altérations de physiologie placentaire.

Perfusion ex vivo du placenta de rongeurs

Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires.

Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline

Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du fer (Fe) représente une approche rentable et polyvalente pour évaluer la biodisponibilité du Fe dans les aliments, les produits alimentaires, les suppléments, les repas et même les régimes alimentaires. Rigoureusement validé par les études humaines, il représente l’état de l’art pour les études de biodisponibilité du Fe.

Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la mesure de la biodisponibilité du fer alimentaire

Nous présentons un protocole standardisé pour la quantification des temps de relaxation T2* des tumeurs à l’aide d’un logiciel externe. Des images d’écho à gradient multi-écho sont acquises et introduites dans le logiciel pour créer des cartes de tumeur T2* et mesurer les temps de relaxation de la tumeur T2*.

Mesure des temps de relaxation de la tumeur T2* après l’administration de nanoparticules d’oxyde de fer

Nous décrivons un test fluorescent qui peut confirmer rapidement et à peu de frais la capacité de nouveaux composés à chélater le fer. Le test mesure la capacité des composés à surpasser l’activité de liaison au fer de la sonde fluorescente chélatrice du fer faible Calcein, ce qui entraîne une augmentation quantifiable de la fluorescence lors de la chélation.

Méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer 

Ce protocole présente des méthodes permettant d’évaluer la distribution et la quantité des dépôts de fer dans les tissus, en particulier le cerveau. Le protocole détaille les procédures de préparation des échantillons, de coloration Perls/DAB, de capture d’images et d’analyse des données.

Évaluation du dépôt de fer dans le cerveau de souris 5xFAD par coloration Perls/DAB

Découvrez une méthode pour quantifier le transport du fer placentaire chez la souris grâce à des isotopes stables non radioactifs. Cette technique permet d'étudier la distribution du fer materno-fœtal en toute sécurité.

Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

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