Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

Ce protocole est important car il permet aux chercheurs de suivre et de quantifier la distribution du fer in vivo sans avoir besoin de radioactivité. Étant donné que plusieurs isotopes stables du fer peuvent être détectés simultanément dans le même échantillon, cette technique peut être utilisée pour comprendre l’absorption, la régulation et la distribution du fer provenant de différentes sources. Pour commencer, ajoutez 12 acides chlorhydriques normaux au fer 58 dans le flacon en verre fourni par le vendeur et remplacez le bouchon en vrac.

Pour dissoudre le fer, réchauffez la solution à 60 degrés Celsius pendant une heure. Si elle n’est toujours pas dissoute, laisser la solution toute la nuit à température ambiante dans la hotte pour la dissoudre. Ensuite, pour générer la solution de chlorure ferrique, oxyder tout chlorure ferreux restant en réchauffant la solution à 60 degrés Celsius avec le bouchon éteint pour faciliter l’oxydation.

Ajouter un microlitre de peroxyde d’hydrogène à 35% par 50 microlitres de solution pour faciliter davantage l’oxydation. Laissez la solution de chlorure ferrique dans la hotte à 60 degrés Celsius avec le bouchon enlevé pour évaporer l’échantillon. Reconstituez ensuite le chlorure ferrique à 100 millimoles avec de l’eau ultrapure.

Calculez la quantité d’eau requise en fonction du poids initial du métal. Ensuite, préparez un millilitre de nitrilotriacétate ferrique en incubant la solution de chlorure ferrique préparée avec du nitrilotriacétate à un rapport molaire d’un à cinq en présence de 20 millimolaires de bicarbonate de sodium pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre 500 milligrammes d’apotransferrine dans quatre millilitres de tampon de transfert et de chargement, et ajouter quatre millilitres de cette solution d’apotransferrine à la solution de nitrilotriacétate ferrique préparée dans le tube de 15 millilitres.

Pour permettre une charge maximale de nitrilotriacétate ferrique sur l’apotransferrine, vérifier que la solution est à pH 7,5 et ajuster le pH si nécessaire avec du bicarbonate de sodium ou de l’acide chlorhydrique. Incuber le mélange pendant 2 1/2 heures à température ambiante. Ensuite, retirez l’excès de nitrilotriacétate ferrique non lié et libérez le nitrilotriacétate en transférant la solution de transferrine de fer 58 sur une colonne de coupure de poids moléculaire et en centrifugeant la colonne.

Après centrifugation, laver la colonne deux fois en ajoutant 10 millilitres de tampon de charge de transferrine et en centrifugeant la colonne. Ensuite, lavez la colonne avec 10 millilitres de solution saline et centrifugez à nouveau. Enfin, stérilisez la solution de transferrine de fer 58 à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.

Préparer une solution de transferrine de fer 58 à 35 milligrammes par millilitre dans une solution saline. Ensuite, placez une souris enceinte anesthésiée sur un coussin chauffant et injectez lentement et soigneusement la solution de transferrine de fer 58 dans le sinus rétro-orbitaire. Six heures après l’injection, euthanasiez la souris et retirez soigneusement l’utérus à l’aide d’une pince stérile et de ciseaux à dissection.

Couper une unité placentaire fœtale comprenant un seul fœtus et un placenta dans le sac amniotique entouré d’une partie de l’utérus. Ensuite, coupez soigneusement l’utérus et le sac amniotique sans déranger le fœtus et le placenta. Ensuite, retirez le sac amniotique et retirez le fœtus et le placenta.

Après avoir coupé le cordon ombilical, épongez le fœtus et le placenta lors d’une lingette propre pour éliminer l’excès de liquide amniotique et notez le poids de l’ensemble du placenta. Coupez chaque placenta en deux avec une lame de rasoir. Placez chaque moitié dans un tube de deux millilitres et congelez dans de l’azote liquide.

Pour recueillir les foies embryonnaires, sacrifiez l’embryon et épinglez l’embryon pour la stabilisation en laissant l’abdomen exposé. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une petite incision à l’endroit où le cordon ombilical était attaché. Insérez une extrémité du ciseau de dissection dans l’incision et effectuez une coupe du plan médian de 1/4 de pouce vers le plan coronal.

Ensuite, effectuez des coupes transversales planes pour exposer le foie fœtal. À l’aide de forceps, retirez le foie fœtal et notez le poids de l’ensemble du foie embryonnaire. Placez le foie de l’embryon entier dans un tube de deux millilitres et congelez-le dans de l’azote liquide.

Conservez les mouchoirs indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour quantifier le fer non hémique dans le placenta et le foie fœtal, décongelez les moitiés placentaires et les foies fœtaux entiers. Pesez ensuite les moitiés placentaires.

Ajouter 400 microlitres de solution de précipitation protéique aux échantillons de tissus et homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur électrique. Incuber les échantillons à 100 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, refroidissez-les à température ambiante pendant deux minutes.

Ouvrez les bouchons pour relâcher la pression. Puis fermez à nouveau les tubes. Après avoir centrifugé l’échantillon pour granuler les débris tissulaires, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube marqué pour l’analyse ICP-MS.

Ensuite, pour quantifier le fer hémique, notez le poids de la pastille obtenue après centrifugation. Digérez ensuite les granulés dans 10 millilitres d’acide nitrique concentré à 70%, complété par un millilitre de peroxyde d’hydrogène à 30%. Chauffer les échantillons à 200 degrés Celsius pendant 15 minutes avant de les envoyer pour analyse ICP-MS.

La mesure ICP-MS a permis la détection de deux isotopes de fer différents. L’isotope du fer le plus abondant, le fer 56, reflète les changements ioniques chroniques dans les tissus. Un autre isotope, le fer 58, reflète des changements aigus dans la distribution du fer injecté.

La mesure du fer 56 a confirmé que les foies d’embryons issus de grossesses déficientes en fer avaient diminué les réserves de fer par rapport à ceux des grossesses remplies de fer. La mesure du fer 58 a confirmé que dans les grossesses déficientes en fer, moins de fer a été transféré au foie embryonnaire en six heures que dans les grossesses remplies de fer. Lors de l’exécution de la procédure, n’oubliez pas d’enregistrer le poids des tissus.

Ces poids sont nécessaires pour calculer les concentrations de fer. Étant donné que le fer 58 ne nécessite pas de précautions particulières de manipulation et d’élimination, les tissus non transformés peuvent être utilisés pour d’autres analyses, y compris, mais sans s’y limiter, le transfert Western ou qPCR.