Name: Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez l'interférence ARN chez le cafard américain pour étudier les mécanismes moléculaires du développement, de la régénération et du comportement. Cette méthode permet d'explorer la fonction génique dans les organismes non modèles.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n° 32070500, 31620103917, 31330072 et 31572325 à C.R., Sh.L.), par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n° 2021B1515020044 et 2020A1515011267 à C.R.), par le Département des sciences et de la technologie de la province du Guangdong (subventions n° 2019B0905003 et 2019A0102006), par le Département des sciences et de la technologie de Guangzhou (subvention n° 202102020110), par le Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 à Sh.L.).

La ligne de P. americana a été initialement fournie par le Dr Huiling Hao. Cette espèce est maintenue avec la consanguinité depuis 30 ans9.
1. Éclosion et alimentation de P. americana
<ol><li>Recueillir les oothèques fraîches (immédiatement après la ponte) de P. americana et incuber dans l’incubateur sombre à 25 °C et 60 % d’humidité pendant environ 25 jours. Augmentez ensuite la température et l’humidité à 30 °C et 75% 3 jours avant l’éclosion.</li>
	<li>Utilisez un tamis avec une ouverture de 4 mm pour séparer les nymphes hachées des oothèques.</li>
	<li>Gardez les nymphes dans des récipients cylindriques (12 cm de diamètre et 10 cm de hauteur) dans l’obscurité à 28 °C, 70% d’humidité. Brossez le bord intérieur des récipients avec de la vaseline pour empêcher les cafards de s’échapper. Fournissez de la nourriture, de l’eau et un abri aux rats (plateaux à œufs). Faites attention à l’activité des nymphes et nettoyez régulièrement les excréments et les débris.</li>
</ol>2. Sélection des nymphes dans l’amidon approprié
<ol><li>Utilisez un tube en verre pour choisir le P. americana fraîchement fondu (couleur blanche). Conservez-les dans de nouveaux contenants et attendez le bon stade pour le traitement. REMARQUE: Après ~ 19 jours dans les conditions d’alimentation ci-dessus, les nymphes dans les 3èmes instars seront disponibles pour injection. La couleur des cafards fraîchement mués est blanche et les instars sont clarifiées par les temps de mue.</li>
</ol>3. Préparation du fragment cible avec des promoteurs T7
<ol><li>En utilisant l’ADNc de P. americana comme modèle, concevoir des amorces appariées pour effectuer la PCR afin d’obtenir un fragment d’ADN de 300 à 800 bp du gène cible9. Ensuite, clonez le fragment pcR dans un vecteur pTOPO (voir Tableau des matériaux) pour le séquençage.</li>
	<li>En utilisant l’ADN du fragment cible comme modèle, synthétisez une nouvelle paire d’amorces avec séquence promotrice T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') aux bornes 5' et effectuez un autre cycle de PCR pour obtenir le fragment cible avec des promoteurs T7 de chaque côté9.</li>
</ol>4. Transcription et synthèse de l’ARNds in vitro
<ol><li>Ajouter 10 μL de tampon T7 2X, 2 μL du mélange enzymatique, T7 Express (voir tableau des matériaux) et 2 μg de produit PCR (obtenu à l’étape 3.2) dans le système de réaction et additionner le volume total à 20 μL avec ddH2O. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 °C pendant 30 min et 70 °C pendant 10 min, puis refroidir lentement à température ambiante.</li>
	<li>Diluer la solution de RNase A (4 μg/μL) avec de la ddH2O dans un rapport de 1:200. Ajouter ensuite 1 μL de DNase sans RNase RQ1 (1 U/μL) et 1 μL de solution diluée de RNase A au système (voir tableau des matériaux). REMARQUE: Maintenant, le volume d’un seul système est de 22 μL.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 30 min. Ajoutez ensuite 10% du volume total (lors de l’exécution simultanée de réactions N, le volume total est N x 22 μL) d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.</li>
	<li>Mélanger doucement à l’envers manuellement, placer sur de la glace pendant 5 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, laver le résidu avec de l’éthanol à 75 % (avec de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) à 25 %), puis centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez à nouveau le surnageant. Sécher la pastille à l’air libre pendant 15 min à température ambiante. Utilisez environ 100 μL d’eau DEPC pour dissoudre l’ARNds, puis diluez l’ARNds jusqu’à la finale 2 μg/μL. REMARQUE: L’ARNds peut être conservé à -80 °C pendant 6 mois.</li>
</ol>5. Chargement de la solution d’ARNds dans la seringue
<ol><li>Configurez le programme dans la pompe de micro-injection (voir Tableau des matériaux) à l’avance pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant. Avant d’utiliser la seringue, nettoyez la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois.</li>
	<li>Installez la seringue de 10 μL sur la pompe de micro-injection, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 μL de solution d’ARNd (préparée à l’étape 4.6). Injecter 1 μL de l’ARNds dans une nymphe du3e stade (voir étape 2) et s’assurer qu’elle ne s’échappe pas dans le corps.</li>
</ol>6. Injection d’ARNd à P. americana
<ol><li>Anesthésiez les cafards avec une concentration accrue de CO2 dans un récipient jusqu’à ce que les cafards ne bougent plus, puis procédez immédiatement à l’injection.</li>
	<li>Ramassez doucement le cafard avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille avec la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. A propos de la profondeur d’insertion, moins c’est, mieux c’est.</li>
	<li>Ensuite, injectez la solution d’ARNd dans le cafard. Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille est aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes. REMARQUE: L’injection doit être faite sous un microscope à dissection.</li>
	<li>Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10-20 min pour les laisser récupérer des effets du CO2 . Étiqueter les contenants avec la date d’injection, le type et la dose d’ARNds et l’âge du P. americana.</li>
	<li>Placez les cafards injectés dans un environnement sombre à 28 ° C, 70% d’humidité, fournissez de l’eau, de la nourriture et un abri, et observez régulièrement les changements possibles dans le phénotype des cafards.</li>
</ol>7. Confirmation de l’élimination et analyse phénotypique
<ol><li>Évaluer l’efficacité de l’ARNi à l’aide de toutes les techniques de biologie moléculaire disponibles telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et le Transfert Western. Pour des procédures détaillées de qRT-PCR et de Transfert Western, voir les références 1,12.</li>
	<li>Pour observer et analyser les phénotypes liés à l’ARNi, utilisez le microscope adapté aux animaux vivants. REMARQUE: L’ARNi peut affecter la morphologie, le comportement, la mue, la régénération des membres et d’autres activités physiologiques des cafards. La fréquence spécifique du phénotype est calculée en fonction de conditions spécifiques.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.+J%29%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’éliminationgénique 13. L’effet résiduel suivant du niveau du gèn...

L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes1, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello2 ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage de l’ARNm et entraîne finalement la perte de la fonction génique 3,4,5. Parmi les espèces d’insectes, de nombreuses expériences systémiques d’ARNi ont jusqu’à présent été rapportées dans de nombreux ordres d’insectes, tels que les orthoptères, les isoptères, les hémiptères, les coléoptères, les neuroptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères etles blattodea 5,6,7,8.
Les cafards (Blattaria) sont une famille d’insectes essentielle dans les études développementales et métamorphiques avec leurs cycles de croissance rapides, leur forte adaptabilité à l’environnement et leur grande plasticité développementale9. Avant de découvrir que l’ARNi était compatible avec les cafards, les recherches précédentes se concentraient uniquement sur la prévention et le contrôle des cafards en raison de la rareté des techniques de manipulation génétique chez les cafards. La structure unique de l’oothèque de cafard rendait difficile l’exécution d’un knockout génétique basé sur l’injection d’embryons avec le système CRISPR-Cas9. En outre, la plupart des tissus chez les cafards (tels que P. americana) présentent une réponse systémique robuste à l’ARNi, permettant la génération rapide de phénotypes dysfonctionnels en injectant un ou plusieurs ARNd ciblant 9,10,11. Ces caractéristiques ont fait de l’ARNi une technique indispensable dans la recherche fonctionnelle sur les gènes chez P. americana.
Même si l’utilisation de l’ARNi dans la recherche sur les gènes fonctionnels chez P. americana a été rapportée, aucune description détaillée ou étape par étape n’était disponible. Ce rapport fournit une ligne directrice opérationnelle étape par étape pour l’ARNi chez P. americana, utile pour l’étude de la fonction génique chez d’autres cafards. De plus, ce guide ne se limite pas à Blattodea et peut être appliqué à de nombreux autres insectes avec des modifications mineures.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 et micro ; L Syr (26s/51/2)</td><td>Hamilton</td><td>PN :80300</td><td>Incubateur d’injection</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>Pour l’éclosion et l’alimentation des cafards</td></tr><tr><td>Micro-pompe d’injection</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>Injection</td></tr><tr><td>pTOPO-Blunt Cloning Kit</td><td>Aidlab Biotechnology</td><td>CV16</td><td>Pour le clonage</td></tr><tr><td>de gènes Systèmes quantitatifs de PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>Pour l’analyse qRT-PCR</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>Pour la synthèse de dsRNA, qui contient de la Rnase A Solution (4 &mu ; g/&mu ; L), acétate de sodium, 3,0 M (pH 5,2), mélange d’enzymes, T7 Express, eau sans nucléases, tampon Express T7 2x, thermocycleurs DNase sans RNase RQ1</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>pour l’amplification de l’ADN</td></tr></tbody></table>

applications de l’interférence arn chez le cafard américain

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.

La figure 1 montre une injection réussie. La seringue de micro-injection avec une aiguille de micro diamètre doit être placée horizontalement sur le booster (Figure 1A). L’aiguille est insérée par l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme (Figure 1B). Assurez-vous que le liquide pénètre dans l’abdomen de P. americana . L’angle trop raide de l’aiguille endommagera les organes internes...

Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.

Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Le protocole fournit un moyen simple d’étudier les cafards américains. Un ravageur sanitaire commun et un insecte bénéfique pour la médecine traditionnelle chinoise. Il aidera à explorer les mécanismes moléculaires de multiples activités de vie des cafards américains en détruisant des gènes spécifiques.Le principal avantage de cette technologie est qu’elle peut détruire des gènes chez les cafards américains ou d’autres insectes similaires qui ne conviennent pas à l’édition de gènes. Cette technologie peut être utilisée pour explorer divers domaines tels que la régulation génétique et épigénétique, le processus de développement des tissus, la régénération des appendices, le comportement d’accouplement et d’autres aspects intéressants du cafard américain. Cette technologie est facile à utiliser et polyvalente.Nous suggérons de garder les animaux en bonne santé pendant le traitement par injection de DSRA. Je crois que les novices peuvent facilement maîtriser cette technique après plusieurs séances d’entraînement. Pour commencer, séparez les nymphes hachées des oothèques avec un tamis à ouverture de quatre millimètres.Choisissez le P.americana blanc fraîchement malté avec un tube en verre. Placez le P.americana dans de nouveaux récipients et attendez le bon stade pour le traitement. Dans le système de réaction, ajoutez 10 microlitres de tampon T7 2X, 2 microlitres du mélange d’enzymes T7 Express et deux microgrammes de produit PCR.Enfin, augmentez le volume total à 20 microlitres avec de l’eau double distillée. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Diluer 4 microgrammes par microlitre de solution de RNase A avec de l’eau DEPC dans un rapport de 1 à 200.Ajoutez ensuite 1 microlitre d’une unité par microlitre RQ1 RNase Free Dnase et 1 microlitre de solution diluée de RNase A au système. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 10% du volume total d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.Mélanger doucement à l’envers manuellement, puis placer sur de la glace pendant cinq minutes et centrifuger à 13 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez le résidu avec de l’éthanol à 75%, avec de l’eau traitée à 25% de DEPC, puis centrifugez à 13 000 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.Retirez à nouveau le surnageant, séchez la pastille à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre l’ARN double brin avec environ 100 microlitres d’eau DEPC et le diluer à la concentration finale de 2 microgrammes par microlitre. Configurez le programme dans la pompe à micro-injection pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant.Nettoyez ensuite la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois. Installez la seringue de 10 microlitres sur la micro-pompe d’injection. Ensuite, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 microlitres de solution d’ARN double brin.Anesthésiez les cafards avec du dioxyde de carbone, puis ramassez-les doucement avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille à la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. Injectez la solution d’ARN double brin dans le cafard en veillant à ce que la pointe de l’aiguille soit aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes.Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10 à 20 minutes pour les laisser se remettre des effets du dioxyde de carbone.Étiqueter les récipients avec la date d’injection, le type et la dose d’ARN double brin et l’âge du P.americana. Ddc ou DOPA décarboxylase et Dpp ou gènes décapentaplégiques ont été sélectionnés comme deux exemples pour observer le phénotype des cafards maltés après injection d’ARN double brin et dsMocK qui n’a pas de cible chez les animaux a été pris comme un témoin négatif. L’efficacité de l’ARNi a été détectée par qRT PCR.Les gènes ont été significativement détruits avec une valeur P inférieure à 0,01 pour dsDdc et inférieure à 0,05 pour dsDpp. P.americana avec les gènes Ddc knockdown avait l’épiderme blanc en raison de la mélanisation bloquée. Dans l’expérience avec des injections de dsDpp, l’ARNi a perturbé la régénération des membres.Les insectes doivent être en bonne santé et injectés sans dommage. Cette technologie fournit un moyen simple d’explorer les fonctions des gènes pour les insectes qui ne peuvent pas être modifiés par des gènes tels que le cafard américain.

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ARN interférence a été prouvé très efficace pour analyser la fonction des gènes...

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interférence ARN (ARNi) est un outil extrêmement précieux pour découvrir la fonction des gènes. Cependant, la capacité de cibler des gènes à l’aide de l’ARNi au cours des stades préadultes est limitée chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae. Nous décrivons un protocole ARNi pour réduire la fonction des gènes par injection directe pendant le développement de la nymphe.

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