Protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains

La recherche sur les embryons humains est limitée par leur faible disponibilité et leurs préoccupations éthiques, de sorte que l’obtention de modèles individuels qui reproduisent fidèlement le développement humain précoce soutiendrait le progrès scientifique et médical. La capacité de cette technique à prédire le développement humain dépend de sa capacité à reproduire efficacement les séquences de détermination cellulaire blastocyste et de morphogenèse, en fonction de la séquence et du rythme de développement, et une telle modélisation assurerait la formation de cellules qui reflètent vraiment le stade de blastocyste. À l’avenir, les blastoïdes humains pourraient être utilisés pour identifier des cibles thérapeutiques et contribuer à la modélisation préclinique, par exemple, pour améliorer un milieu de fécondation in vitro ou pour développer des contraceptifs non hormonaux.

Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer et Giovanni Sestini feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez et préchaudez les milieux PXGL, les milieux de base N2B27, le tampon de lavage, le PBS et les milieux d’agrégation. Exclure les MEF de la suspension hPSC pour la formation de blastoïdes.

Pour l’exclusion meF, préparer une plaque enduite de gélatine en ajoutant un millilitre de 0,1 % de gélatine dans le puits d’une plaque à six puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 à 90 minutes. Pour récolter les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec un millimètre de PBS.

Ajouter 500 microlitres de solution de détachement cellulaire à chaque puits d’une plaque de six puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez les cellules au microscope pour suivre la dissociation des colonies en cellules individuelles. Diluer la solution de détachement cellulaire avec un millilitre de tampon de lavage.

Prélever les cellules de la plaque en pimentant doucement cinq à 10 fois. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes.

Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1,5 millilitre de milieu PXGL dans chaque puits. Ensemencez les cellules sur les plaques recouvertes de gélatine pour l’exclusion MEF et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 60 à 90 minutes. Une fois que les cellules naïves sont ensemencées pour l’exclusion MEF, retirez le PBS de MicroWells et équilibrez les puits avec 200 microlitres de milieu basal N2B27 pour chaque puce MicroWell, et incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.

Recueillir le surnageant contenant les cellules naïves non attachées. Transférez-le dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes. Jetez le milieu et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu basal N2B27.

Comptez les cellules à l’aide de diapositives de comptage de cellules. Faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes. Jeter le milieu et ajouter une quantité appropriée de milieu N2B27 contenant 10 micromolaires Y27632 pour obtenir une densité cellulaire de 30 000 cellules pour 50 microlitres.

Retirez le support des réseaux MicroWell équilibrés et ajoutez 25 microlitres de supports N2B27 avec 10 micromolaires Y27632. Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de tomber dans le fond du MicroWell. Ajoutez ensuite 125 microlitres de milieu N2B27, complétés par 10 micromolaires Y27632.

Dans les 24 heures, des agrégats de CSEh naïfs seront observés sur la puce MicroWell. Initier la formation de blastoïdes en préparant le milieu PALY. Prévassez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Retirez le milieu d’agrégation et ajoutez 200 microlitres de milieu PALY préavertissé aux MicroWells. Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 degrés Celsius. Répétez le changement de média le premier jour.

Le deuxième jour, retirez le milieu PALY et ajoutez 200 microlitres de milieu N2B27, complétés par du LPA et 10 micromolaires Y27632. Répétez le changement de média le troisième jour. La formation complète de blastoïdes se produit au quatrième jour.

Préparez une suspension naïve de cellules hPSC pour la formation de blastoïdes comme décrit précédemment. Jeter le milieu et ajouter une quantité appropriée de milieu N2B27 contenant 10 micromolaires Y27632 pour obtenir la densité cellulaire de 70 cellules pour 100 microlitres du milieu. Pour regrouper les cellules au fond des puits, centrifuger la plaque à 200 FCR pendant deux minutes à température ambiante.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans des conditions de culture hypoxique. Dans les 24 heures, des agrégats de CSEh naïfs seront observés sur les puits. Ajouter 100 microlitres de milieu PALY fraîchement préparé et préavertissé deux fois.

Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, jetez la moitié du support et remplacez-le par 100 microlitres de support PALY préavertis. Répétez l’étape jusqu’au quatrième jour.

Préparez une suspension naïve de cellules HPSC pour la formation de troposphère comme décrit précédemment. Une fois que des agrégats de HPSC naïfs se sont formés après 24 heures, échangez le milieu d’agrégation avec PALY sans LIF, complété par trois SC144 micromolaires pour former des trophosphères représentant le trophectoderme précoce. Pour former des trophosphères représentant le trophectoderme mature, échangez le milieu d’agrégation avec PALY, complété par deux XMUMP1 micromolaires.

Actualisez le support tous les jours. La formation complète de la trophosphère se produit au quatrième jour. Pour évaluer les états cellulaires, comparez les données transcriptomiques des blastoïdes et des trophosphères avec les témoins appropriés, y compris les cellules souches trophoblastiques humaines de type post-implantation.

Les CSEh naïfs cultivés dans le PXGL étaient des structures agrégées et cavitées qui ont émergé entre 48 et 72 heures après l’induction paLY et ont atteint un diamètre de 150 à 250 micromètres en 96 heures. Sur la base de paramètres morphométriques et de la présence des trois lignées, l’efficacité d’induction a atteint 70 à 80% Les trophosphères se sont formées à 50 à 60% d’efficacité dans les 96 heures suivant l’induction. La formation de blastoïdes a été couronnée de succès dans les plaques de 96 puits à fixation ultra faible disponibles dans le commerce dans des conditions d’induction optimisées.

La technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire a été utilisée pour caractériser davantage l’état des cellules blastoïdes. Les cellules affichent des profils de clustering nettement reproductibles, quels que soient les paramètres utilisés pour effectuer le clustering et la visualisation des données, ce qui a permis de distinguer les trois lignées de blastocystes en toute confiance. Entre 24 et 60 heures, les cellules souches pluripotentes PXGL forment des analogues de l’épiblaste et du trophectoderme.

Ensuite, entre 60 et 96 heures, des analogues du trophectoderme polaire et de l’endoderme primitif se forment. C’est la séquence de spécification au sein du blastocyste, donc les blastoïdes récapitulent la séquence de développement de la spécification de la lignée. La fusion des ensembles de données blastoïdes avec l’ensemble de données de référence des cellules isolées d’embryons à différents stades de développement a montré que 97% des cellules de blastoïdes se regroupaient avec les cellules blastocystes, mais pas avec des cellules d’embryons post-implantation.

Une analyse indépendante a confirmé qu’au fil du temps, les cellules souches ont formé des cellules qui correspondaient transcriptionnellement aux cellules d’embryons humains entre le cinquième et le 7,5e jour. C’est en effet le stade de développement au cours duquel le blastocyste humain se forme. Ils ont également confirmé que plus de 95% des cellules dans les blastoïdes ont un transcriptome qui correspond aux trois lignées cellulaires des blastocystes, tandis que 3% des cellules étaient hors cible et appariées avec les stades post-implantation.

Il est à noter que nous avons observé que nos cultures 2D initiales comprennent également environ 5% des cellules hors cible. Le stade de développement équivalent peut également être visualisé en examinant les modèles d’expression de marqueurs spécifiques tels que CDX2 pour le trophectoderme blastocyste et PRMD14 pour l’épiblaste blastocyste. La qualité de la culture PXGL initiale est absolument cruciale, et le nombre de cellules dans l’agrégat initial est également critique, et il peut être contrôlé à l’aide de MicroWells.

La taille globale de l’agrégat cellulaire après 24 heures devrait être d’environ 50 à 70 micromètres. La formation efficace de blastoïdes de phase complète ouvre la voie à l’étude des processus d’implantation et de développement post-implantation de l’embryon humain.