Name: Protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Découvrez un protocole de formation de blastoïdes humains à partir de cellules souches pluripotentes naïves. Cette technique reproduit fidèlement le stade blastocyste avec une efficacité de 70 à 80 %.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention ERC-Co n° 101002317 « BLASTOID: une plate-forme de découverte pour l’embryogenèse humaine précoce »). H.H.K. est soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Nous remercions Yasuhiro Takashima d’avoir partagé les lignées cellulaires H9 et H9-GFP, et Austin Smith, Peter Andrews et Ge Guo d’avoir partagé les lignées cellulaires HNES1, Shef6, niPSC 16.2b et cR-NCRM2. Nous remercions Hossein Baharvand d’avoir partagé les organoïdes de l’endomètre. Nous remercions Joshua M. Brickman d’avoir partagé l’ARN isolé à partir de cellules différenciées PrE et de cellules nEND. Nous remercions Shankar Srinivas d’avoir partagé les données de séquençage de l’ARN unicellulaire de l’embryon de péri-gastrulation. Nous remercions Aleksand Bykov et Luisa Cochella pour leur assistance technique pour la préparation de la bibliothèque SMARTSeq2. Nous remercions l’installation NGS, Biooptic et Stem Cell de l’IMBA pour son aide essentielle.

L’Institut de biotechnologie moléculaire de l’Académie autrichienne des sciences a déposé une demande de brevet EP21151455.9 décrivant les protocoles de formation de blastoïdes humains et le test d’interaction blastoïde-endomètre. HK, AJ, HHK et NR sont les inventeurs de ce brevet. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Dans la présente étude, nous montrons, étape par étape, comment établir des blastoïdes humains à haut rendement en utilisant un protocole simple et robuste. Lors de l’agrégation des HSPC PXGL naïfs et de leur triple inhibition, les blastoïdes se forment efficacement (> 70%) et génèrent séquentiellement les 3 analogues de blastocystes en 4 jours. Des limitations dans l’efficacité et la qualité des blastoïdes (par exemple, la présence de cellules hors cible) peuvent survenir si l’état initial est sous-optimal. Il est à noter que nous avons mesuré que les CSH PXGL contiennent environ 5% de cellules reflétant les étapes post-implantation. Ces cellules pourraient limiter la formation de blastoïdes de haute qualité. Au-delà de l’état PXGL naïf initial qui reflète l’épiblaste du blastocyste, un autre facteur pivot est le milieu utilisé pour la formation de blastoïdes. Afin de former rapidement des cellules de type blastocyste et d’empêcher la formation de cellules hors cible, de type post-implantation, nous proposons que l’inhibition des voies triples (Hippo, ERK, TGF-β) est essentielle. Alors que différentes lignées cellulaires donnent des rendements différents de blastoïde lors de l’inhibition de l’ERK / TGF-β (généralement autour de 10% à 20%), l’exposition au LPA entraîne la formation d’un rendement blastoïde tout aussi élevé dans toutes les lignées cellulaires, tout en utilisant des critères morphométriques et de spécification de lignée stricts. LPA agit peut-être sur l’inhibition de la voie hippopotame, qui joue un rôle essentiel dans la première ségrégation de lignée entre les lignées épiblastique et trophectoderme chez la souris et l’homme 8,51. L’amélioration significative de l’efficacité blastoïde par LPA suggère que les mécanismes de spécification de la cellule interne-externe médiés par la voie Hippo en jeu dans le blastocyste sont cooptés lors de la formation du blastoïde. Une limitation actuelle réside dans le fait que, en raison d’une sous-optimalité des protocoles utilisés pour cultiver des blastocystes humains ou des blastoïdes au jour équivalent temps 7-13 (après la formation de blastocystes / blastoïdes), nous ne sommes pas en mesure d’évaluer dans quelle mesure nous pouvons modéliser correctement le développement post-implantation.
L’analyse de l’état transcriptomique des cellules blastoïdes peut facilement être réalisée à l’aide de scRNAseq, de cartes de référence adéquates et de méthodes bioinformatiques. Auparavant, l’analyse transcriptomique a montré que les CSEh cultivés dans PXGL sont plus similaires à l’épiblaste de blastocyste par rapport à l’état amorcé. Des limitations dans l’analyse des données peuvent survenir si la carte de référence ne comprend que des cellules au stade de blastocyste. La carte de référence devrait inclure des cellules provenant d’embryons post-implantation afin d’évaluer la présence de cellules potentielles hors cible. À l’avenir, afin de comparer les cellules blastoïdes, une carte de référence incluant tous les tissus du conceptus humain pré-et post-implantation serait extrêmement précieuse. En outre, les cartes de référence unicellulaires multi-omiques, par exemple incluant le transcriptome, l’accessibilité de la chromatine et la méthylation de l’ADN, aideraient davantage. Enfin, des méthodes bioinformatiques normalisées permettant d’évaluer quantitativement les similitudes entre les cellules à partir de modèles embryonnaires et de concepts de référence, et d’identifier positivement les cellules hors cible aideraient davantage à analyser et à comparer les résultats de manière impartiale.
Dans l’ensemble, les blastoïdes formés par la triple inhibition des voies Hippo, TGF-β et ERK possèdent les quatre caractéristiques de 1) morphogenèse très efficace, 2) séquence correcte de spécification de la lignée, 3) grande pureté des cellules de type blastocyste au niveau du transcriptome, 4) capacité à modéliser le développement péri-implantation. Ces caractéristiques des blastoïdes faciliteront la construction d’hypothèses sur le développement et l’implantation de blastocystes, mais elles ne récapitulent pas les premiers stades du développement embryonnaire. Contrairement à l’accessibilité et à la polyvalence limitées des blastocystes humains, les blastoïdes se prêtent aux tests génétiques et médicamenteux pour les études fonctionnelles du développement et de l’implantation des blastocystes. À l’avenir, ces connaissances de base pourraient contribuer à améliorer la formulation des supports de FIV, à développer des contraceptifs post-fécondation et à mieux gérer les grossesses précoces.

Le manque de modèles expérimentaux a limité la compréhension de l’embryogenèse humaine précoce. Les connaissances actuelles sur les aspects spécifiques à l’homme du développement embryonnaire proviennent d’embryons excédentaires de fécondation in vitro (FIV) donnés pour la recherche. Cependant, la disponibilité limitée, les difficultés des manipulations expérimentales et la qualité variable des embryons entravent les recherches scientifiques. Au contraire, un modèle in vitro fidèle d’embryons humains permettrait des manipulations expérimentales complexes, offrant ainsi une opportunité éthique de compléter la recherche sur les embryons humains 1,2,3,4. Un modèle précédemment développé de blastocystes de souris combinait des cellules souches embryonnaires de souris et des cellules souches trophoblastiques5. Dans ce protocole détaillé, une méthode pour générer un modèle du blastocyste humain à partir de cellules souches pluripotentes naïves et fidèle aux critères élémentaires du blastocyste est décrite6.
Quatre critères pour les blastoïdes humains. Ici, dans une tentative d’établir une définition standardisée des blastoïdes humains, nous proposons quatre critères minimaux. Bien qu’ils ne soient pas exhaustifs, ces critères pourraient servir de base pour évaluer les paramètres qui permettent la formation de blastoïdes humains (figure 1A). (1) Les blastoïdes devraient se former efficacement en termes de morphologie et de génération des analogues des trois lignées, à savoir l’épiblaste (Epi), le trophectoderme (TE) et l’endoderme primitif (PrE). L’inefficacité est susceptible de pointer vers un état cellulaire initial inadéquat et/ou un état de culture inadéquat (p. ex., milieu blastoïde). (2) Les blastoïdes doivent générer des analogues des trois lignées en fonction de la séquence de développement (Epi/TE en premier, PrE/polarTE en dernier)7,8 et du moment (induction ~ 3 jours; jours embryonnaires 5-7)7,9. (3) Les blastoïdes doivent former des analogues du stade blastocyste, mais pas des stades post-implantation (par exemple, épiblaste post-implantation, trophoblaste ou cellules amnion). (4) Enfin, les blastoïdes devraient être capables de récapituler les caractéristiques fonctionnelles de l’implantation et du développement des blastocystes. En utilisant ce protocole, les blastoïdes humains se forment efficacement en utilisant plusieurs lignées cellulaires (>70%), sont capables de générer les analogues cellulaires des blastocystes séquentiellement et dans les 4 jours, et les analogues sont transcriptionnellement similaires au stade blastocyste (>96% sur la base de plusieurs analyses)6,10,11. Enfin, les blastoïdes génèrent de manière robuste l’axe embryonnaire-abémbryonique, ce qui leur permet d’interagir avec les cellules de l’endomètre stimulées hormonalement à travers la région polaire et d’étendre de manière robuste les lignées lors d’une culture prolongée (équivalent temporel: jour embryonnaire 13).
L’importance de l’état initial de la cellule. Les cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) peuvent être stabilisées dans différents états qui tentent de capturer des stades de développement précis. Ces états sont maintenus par des conditions de culture qui, bien que toujours sous-optimales, contraignent les cellules dansun stade épiblastique préimplantatoire (~ jours embryonnaires 5-7) ou post-implantation (~ jours embryonnaires 8-14). L’analyse transcriptomique a montré que les CSEh cultivés dans PD0325901, XAV939, Gö6983 et le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF; appelé hPSC naïf PXGL)13,14 sont plus similaires à l’épiblaste blastocyste par rapport aux CSH cultivées dans le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 2 et l’activine15 (appelées hPSC amorcées12) et aux cellules souches pluripotentes étendues humaines (hEPSC)16 (voir l’analyse dans les références17, 18,19). En conséquence, le transcriptome des CSEh amorcé correspond le mieux à une épiblaste de singe cynomolgus post-implantation/pré-gastrulation20. Des critères moléculaires supplémentaires, tels que l’expression du transposon, la méthylation de l’ADN et l’état du chromosome X, ont confirmé que les variations de l’état naïf ressemblent davantage à l’épiblaste de blastocyste qu’à l’état amorcé17,21. Enfin, des lignées de CSEh naïfs ont été dérivées avec succès directement de blastocystes en utilisant les conditions de culture PXGL22.
Les cellules blastocystes précoces humaines ne sont pas encore engagées. La spécification de la lignée murine se produit à partir du stade morula qui précède le stade blastocyste23. Au contraire, des expériences de dissociation et de réagrégation ont montré que les cellules trophectodermiques humaines des blastocystes précoces ne sont pas encore engagées24. En conséquence, l’analyse des cellules des blastocystes humains par séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) a montré que la première spécification de lignée (trophoblaste/épiblaste) se produit après la formation de la cavité blastocyste7. Cette spécification humaine différée est en corrélation avec les observations selon lesquelles les CSEh sont puissants pour formerdes trophoblastes 25,26,27 lorsque les CSP de souris sont largement engagés dans la lignée épiblastique. Ces observations combinées ont conduit à la possibilité que les CSH naïfs reflètent un stade de blastocyste et conservent le potentiel de former les trois lignées de blastocystes. Dernièrement, la puissance des CSEh pour spécifier des analogues extraembryonnaires a été proposée pour passer du trophectoderme à l’amnion au cours de la progression de l’état naïf à l’état amorcé27. Ainsi, les HSPC naïfs sont plus similaires au stade préimplantatoire 17,18,21 et ont une capacité accrue à former des trophoblastes par rapport aux hPSC27 amorcés, aux hEPSC16 ou aux états reprogrammés intermédiaires28, qui sont susceptibles de former des analogues post-implantation10 (Figure 1B ). L’état cellulaire initial est donc crucial pour former les analogues extraembryonnaires appropriés. Bien qu’une analyse côte à côte approfondie des analogues du trophectoderme convertis reste à faire, un état naïf PXGL reflétant le blastocyste précoce semble important pour former des blastoïdes haute fidélité.
Incitation à la spécification et à la morphogenèse en signalant l’inhibition des voies. L’inhibition de la voie de signalisation Hippo est un mécanisme conservé conduisant à la spécification des trophoblastes chez les souris, les vaches et les humains 9,29,30. Aussi, depuis 2013, on sait que l’inhibition du NODAL (A83-01) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK; PD0325901 ou équivalent) et l’activation des voies de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) déclenchent des CSH amorcés pour activer le réseau transcriptionnel associé à la lignée trophoblastique 25,31,32,33,34. De plus, récemment, plusieurs rapports ont également confirmé que l’inhibition des voies NODAL et ERK et l’activation de la BMP facilitent la différenciation des trophoblastes des CSH naïfs 25,31,32,33,34. Enfin, si la spécification des trophoblastes est déclenchée à partir d’un état naïf, les cellules récapitulent les aspects de la progression développementale du trophectoderme26. Cependant, les lignes auto-renouvelantes reflétant le trophectoderme blastocyste n’ont pas été stabilisées in vitro. Selon la spécification des trophoblastes, l’induction du facteur de croissance épidermique (EGF) et des voies de signalisation Wnt ainsi que l’inhibition du HDAC pourraient faciliter la progression du développement des trophoblastes 34,35 et stabiliser les cellules en lignées de cellules souches trophoblastiques humaines (cSH) reflétant les cytotrophoblastes post-implantation 18,35. De telles lignées peuvent être dérivées à la fois de blastocystes et de tissus placentaires35.
La deuxième lignée extraembryonnaire, appelée PrE, est spécifiée d’après les trophoblastes et provient de l’épiblaste 7,9. Contrairement à la PrE36 murine, on pense que la contrepartie humaine est indépendante de la signalisation FGF37,38. Des lignes reflétant l’endoderme extraembryonnaire (appelé nEnd) ont été établies à partir de CSEh naïfs par induction de voies de signalisation à l’aide de l’activine A, Wnt et LIF39. Incompatible avec les expériences d’inhibition embryonnaire, il a été démontré que l’inhibition de l’ERK empêche la formation de telles cellules nEND in vitro39. Jusqu’à présent, de telles lignées n’ont pas été dérivées directement de blastocystes.
Dernièrement, des modèles de l’embryon précoce ont été formés en combinant des variations des milieux précédemment développés pour les hTSC35 et les cellules nEND39, utilisant ainsi des activateurs des voies de signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β), EGF et Wnt28,40. Ces modèles embryonnaires se forment à faible efficacité (10%-20%) et forment des cellules ressemblant au stade post- plutôt qu’au stade préimplantatoire10, y compris des analogues de l’épiblaste post-implantation, du trophoblaste, de l’amnion, de la gastrula, des tissus mésodermiques (~ jour embryonnaire 14) et des cytotrophoblastes10. Au contraire, une triple inhibition des voies Hippo, ERK et TGF-β guide efficacement la formation de blastoïdes comprenant des cellules de type blastocyste41. Avec l’état cellulaire initial, nous proposons que l’inhibition des voies triples (Hippo, ERK, TGF-β) est le deuxième paramètre essentiel pour former des blastoïdes haute fidélité (Figure 1B).
Évaluation de l’état de la cellule et de l’étape réfléchie à l’aide de scRNAseq. Les états des cellules composant des blastoïdes peuvent être évalués par l’analyse scRNAseq. Leur similitude transcriptionnelle avec des stades embryonnaires spécifiques peut être mesurée à l’aide de cellules blastoïdes seules et par comparaison avec des CSEh ou des CSEh amorcés qui reflètent les stades post-implantation20,35. L’exécution d’analyses de grappes à l’aide de différents niveaux de définition révèle comment les sous-populations fusionnent progressivement lorsque la définition diminue, révélant ainsi les similitudes des grappes. Bien que l’optimalité du nombre de grappes puisse être mesurée42, le regroupement à haute résolution renseigne également sur la présence éventuelle de petites sous-populations anormales, reflétant par exemple les stadespost-implantation 10. Les gènes exprimés différemment entre les grappes peuvent fournir des informations sur leurs analogues dans le processus de développement en évaluant les niveaux d’expression des ensembles de gènes de référence qui définissent les lignées spécifiques aux stades. Cela permet de mesurer l’enrichissement des sous-populations de blastoïdes soit par des cartes de distance non supervisées (par exemple, en utilisant des gènes enrichis par le haut), soit par analyse d’enrichissement d’ensembles de gènes (GSEA)43. En utilisant ce protocole blastoïde, seuls trois amas principaux se forment qui reflètent transcriptionnellement les trois lignées de blastocystes. Un groupe comprend à la fois les HSPC naïfs initiaux et l’analogue épiblastique des blastoïdes. L’analyse des cellules à différents moments a montré la nature séquentielle de la spécification des lignées (les trophoblastes commencent à se spécifier dans les 24 heures et les cellules endodermiques primitives dans les 60 heures). Un regroupement à haute résolution a capturé une sous-population de cellules (3,2%) exprimant des gènes spécifiques aux embryons au stade de la gastrulation (éventuellement mésoderme ou amnion). Il convient de noter que les CSH naïfs initiaux comprenaient également 5 % de cellules de type post-implantation, comme décrit précédemment44. Dans une deuxième analyse, les cellules blastoïdes peuvent être fusionnées in silico avec des cellules de référence isolées de concepti à différents stades 45,46,47 afin d’en déduire l’équivalence d’étape. Ici, des cellules isolées à partir de concepti45,46 préimplantatoires, des blastocystes cultivés in vitro 45 et des embryons au stade de gastrulation47 ont été utilisés comme points de référence. En utilisant ce protocole, il a été quantifié que les cellules blastoïdes dépareillées révélées par le regroupement à haute résolution se regroupent en effet avec le mésoderme et l’amnion post-implantation. Dans les étapes futures, l’analyse comparative du transcriptome devrait être complétée par une analyse de l’expression des transposons, de la méthylation de l’ADN et du statut du chromosome X qui fournissent également des repères des stades de développement21.
Évaluation de la formation d’axes et d’autres fonctionnalités des blastoïdes humains. Un blastocyste mature est caractérisé par la formation de l’axe embryonnaire-abémbryonique modelant des trophoblastes pour l’implantation. En utilisant ce protocole blastoïde, un axe se forme de manière robuste illustrée par une maturation des trophoblastes proximaux (par exemple, NR2F2+/CDX2-) qui acquièrent la capacité de se fixer aux cellules organoïdes de l’endomètre uniquement lorsqu’elles sont stimulées hormonalement48,49. La comparaison avec les trophosphères qui ne forment pas l’épiblaste montre que ces cellules internes induisent des trophoblastes adjacents à mûrir de manière à médier l’attachement initial à l’endomètre. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture étendu conçu pour les blastocystes de singe cynomolgus50, les trois lignées du blastoïde se développent constamment pendant six jours supplémentaires (équivalent au jour 13), bien que leur organisation ne reflète pas ce stade de développement.
L’implication des blastoïdes humains à haute efficacité et haute fidélité. La conservation des principes de développement qui ont été découverts dans des organismes modèles est intrinsèquement difficile à tester dans le conceptus humain en raison de l’accès restreint et des difficultés techniques à le manipuler génétiquement et physiquement. Un modèle blastoïde à haute efficacité et haute fidélité permettrait des criblages génétiques et médicamenteux à haut débit, qui sont à la base des découvertes scientifiques et biomédicales. En outre, l’incorporation de modifications génétiques complexes pour modifier et enregistrer les processus biologiques compléterait ces études. Dans l’ensemble, nous proposons que la triple inhibition (Hippo, TGF-β, ERK) des hPSC PXGL naïfs soit conductrice pour la formation efficace de blastoïdes humains haute fidélité répondant aux quatre critères minimaux. La nature évolutive et polyvalente de ce protocole le rend apte à générer des hypothèses ciblées qui peuvent ensuite être validées à l’aide de blastocystes humains. En tant que tels, les blastoïdes humains ne remplaceront pas l’utilisation du conceptus humain pour la recherche in vitro , mais pourraient agir comme un moyen puissant de canaliser la recherche par des approches expérimentales auparavant inaccessibles au cœur du processus de découverte scientifique et biomédicale. Le protocole montre comment former des blastoïdes humains et aussi comment analyser les cellules contenues dans le blastoïde.

<table><tbody><tr><td>Média neurobasal</td><td>en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>en maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X N2 supplemen</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>50X B27 supplément</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>100X Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>en maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>100X Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Medchem express</td><td>HY-10254</td><td></td></tr><tr><td>XAV-939</td><td>Medchem express</td><td>HY-15147</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml ; 6983</td><td>Medchem express</td><td>HY-13689</td><td></td></tr><tr><td>Leucémie humaine recombinante Facteur inhibiteur</td><td>en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Medchem express</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>Acide 1-oléoyl lysophosphatidique (LPA)</td><td>Peprotech</td><td>2256236</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Medchem express</td><td>HY-10583</td><td></td></tr><tr><td>CMRL moyen</td><td>Gibco</td><td>21530027</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10-828-028</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biozym</td><td>B423201</td><td>solution de détachement de cellules</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermofisher</td><td>A1413302</td><td>facteur de croissance extrait de membrane basale</td></tr><tr><td>TROP2</td><td>anticorps R& D systems</td><td>MAB650</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR& alpha ; anticorps</td><td>R& D systems</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>SC-144</td><td>Axon</td><td>2324</td><td></td></tr><tr><td>XMU-MP-1</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-100526</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td></td><td></td><td>Matrice à membrane basale</td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules Countess Lames de comptage de cellules</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Lames</td></tr><tr><td>de comptage de cellules DAPI Solution de coloration</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-570</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

Un modèle du blastocyste humain formé à partir de cellules souches (blastoïde) soutiendrait les progrès scientifiques et médicaux. Cependant, son pouvoir prédictif dépendra de sa capacité à récapituler efficacement, opportunément et fidèlement les séquences de développement des blastocystes (morphogenèse, spécification, modelage) et à former des cellules reflétant le stade de blastocyste. Nous montrons ici que les cellules souches pluripotentes humaines naïves cultivées dans des conditions PXGL puis tripo-inhibées pour l’hippopotame, transformant le facteur de croissance β, et les voies kinases extracellulaires régulées par le signal subissent efficacement une morphogenèse pour former des blastoïdes (>70%). En fonction du calendrier de développement (~ 4 jours), les blastoïdes déroulent la séquence de spécification des blastocystes en produisant des analogues du trophoblaste et de l’épiblaste, suivis de la formation d’analogues de l’endoderme primitif et des trophoblastes polaires. Il en résulte la formation de cellules transcriptionnellement similaires au blastocyste (>96%) et une minorité d’analogues post-implantation. Les blastoïdes se dessinent efficacement en formant l’axe embryonnaire-abémbryonique marqué par la maturation de la région polaire (NR2F2+), qui acquiert le potentiel spécifique de se fixer directionnellement aux cellules de l’endomètre stimulées hormonalement, comme in utero. Un tel blastoïde humain est un modèle évolutif, polyvalent et éthique pour étudier le développement humain et l’implantation in vitro.

Typiquement, les CSEh naïfs cultivés dans PXGL (Figure 2A) sont des structures agrégées et cavitées qui émergent entre 48 et 72 h après l’induction PALLY et atteignent un diamètre de 150-250 μm en 96 h (Figure 2B). En utilisant (1) le nombre optimal de cellules d’ensemencement, (2) la durée de l’agrégation pré-culture avec N2B27 (0 à 24 h), (3) la concentration de composants chimiques individuels (en particulier LPA) et (4) la durée du traitement PALLY, l’efficacité d’induction atteint 70% à 80% tel que défini sur la base de paramètres morphométriques (taille globale de 150-250 μm, cavité régulière unique, groupe de cellules internes unique; Figure 2C,D) et la présence des trois lignées. Un état cellulaire initial sous-optimal et/ou des conditions d’induction entraîneront une formation de blastoïde moins efficace ou inexistante. Pour assurer une efficacité maximale et ne former que des analogues préimplantatoires, il est crucial d’utiliser une culture de haute qualité de PXGL hPSC naïfs. Cela peut être évalué en mesurant par FACS le pourcentage de cellules positives pour les marqueurs de surface SUSD2 (état naïf) et CD24 (état amorcé). D’autres marqueurs de surface spécifiques aux lignées extraembryonnaires hors cible (p. ex., amnion, mésoderme extraembryonnaire) seraient également utiles, mais, à notre connaissance, ils ne sont actuellement pas disponibles. Si l’efficacité de formation obtenue est inférieure aux résultats rapportés, il est important de vérifier soigneusement tous les composants du milieu blastoïde, en particulier le LPA qui est reconstitué dans le PBS et qui, en tant que ligand GPCR, peut être plus instable par rapport aux molécules synthétiques reconstituées dans le DMSO. Dans la plupart des cas, même si le rendement n’est pas maximal, les structures cavitées sont toujours composées des trois lignées de blastocystes. L’émergence de trois lignées de blastocystes et la formation de l’axe embryonnaire-abémbryonique peuvent être confirmées par la coloration par immunofluorescence des marqueurs (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figure 2E,G). Les trophosphères, qui ne sont composées que de TE, aident à disséquer davantage le rôle de la communication intercellulaire. Les trophosphères peuvent se former à une efficacité de 50% à 60% dans les 96 h suivant l’induction (Figure 2H,I). La formation de blastoïdes peut être effectuée non seulement dans des réseaux de micropuits faits maison, mais également dans des plaques de puits à fixation ultra-faible 96 disponibles dans le commerce avec optimisation des conditions d’induction (voir protocole et figure 2J). Les blastoïdes ont également la capacité de se développer pendant 6 jours supplémentaires, ce qui équivaut à l’équivalent en temps de l’embryon du jour 13, avec un protocole de différenciation in vitro (Figure 2K).
Afin de caractériser davantage l’état cellulaire des cellules blastoïdes, la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire doit être utilisée. UMAP est couramment appliqué pour visualiser une distribution d’états cellulaires et une analyse de clustering non supervisée est effectuée dessus pour évaluer la proximité des états cellulaires individuels. Différents paramètres de l’analyse des données unicellulaires peuvent affecter la façon dont les cellules sont affichées dans les UMAP, conduisant ainsi à des grappes avec des positions et des formes spatiales et relatives différentes (Figure 3A). Cependant, dans cette analyse, les cellules affichent des profils de clustering nettement reproductibles, quels que soient les paramètres utilisés pour effectuer le clustering et la visualisation des données, ce qui permet de distinguer avec une grande confiance les trois lignées de blastocystes. Nous avons utilisé comme référence des cellules d’embryons prélevés à différents stades de développement. La fusion de ces ensembles de données montre que la majorité de l’analogue du trophectoderme du blastoïde est regroupée avec un trophectoderme préimplantatoire, mais pas avec des trophoblastes post-implantation (Figure 3B). Ces résultats ont également été confirmés par un consortium indépendant10.
Lorsque des embryons gastrulés de stade 7 (CS7) de Carnegie sont introduits dans la carte de référence, une petite population de cellules blastoïdes (3 %) est regroupée avec les lignées mésoderme et amnion de ces embryons (Figure 3C). Lorsque des cellules de type amnion sont introduites dans la carte de référence, une petite population de cellules blastoïdes (&lt; 2%) regroupées avec de telles cellules de type amnion.
Dans l’ensemble, seules les structures comprenant une seule cavité régulière, un seul amas de cellules internes, une taille globale allant de 150 à 250 μm, comprenant des analogues transcriptomiques des trois lignées de blastocystes, et largement dépourvues d’autres lignées (par exemple, amnion, mésoderme, mésoderme extraembryonnaire) sont considérées comme des blastoïdes humains.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig01.jpg"> Figure 1 : Quatre caractéristiques et deux approches pour générer des blastoïdes haute fidélité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig02.jpg"> Figure 2 : Blastoïdes et trophosphères dérivés d’agrégats de cSEh naïfs. (A) Images à contraste de phase montrant des CSH naïfs cultivés dans un milieu PXGL co-cultivé avec du MEF irradié. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Images à contraste de phase montrant le changement morphologique d’agrégats naïfs de CSH cultivés sur un réseau de micropuits d’hydrogel non adhérent avec un LPA (milieu PALLY) de 500 nM. Barre d’échelle: 200 μm. (C) Blastoïdes humains formés sur un réseau de micropuits après 96 h. Barres d’échelle: 400 μm. (D) Quantification du pourcentage de micropuits contenant un blastoïde humain induit par l’état de culture PALLY avec une concentration optimisée de LPA à partir de différentes lignées naïves de hPSC (n = 3 réseaux de micropuits). (E) Coloration par immunofluorescence des blastoïdes humains avec des marqueurs d’épiblaste (EPI) (jaune) NANOG et OCT4; les marqueurs TE (cyan) CDX2 et GATA3; et le marqueur endodermique primitif (magenta) SOX17 et GATA4. Barre d’échelle: 100 μm. (H-I) Quantification du nombre de cellules (à gauche) et du pourcentage de cellules (à droite) appartenant à chaque lignée dans le blastoïde (96 h) sur la base de la coloration par immunofluorescence de OCT4, GATA3 et GATA4. (G) Coloration par immunofluorescence des blastoïdes humains pour CDX2 (cyan) et NR2F2 (magenta). (F) Images à contraste de phase de trophosphères précoces et tardives sur réseau de micropuits induites par l’ajout de 3 μM SC144 (H) ou 2 μM XMU-MP-1 (I), respectivement. (J) Images à contraste de phase montrant le changement morphologique d’agrégats naïfs de CSH cultivés dans une plaque de puits 96 à fixation ultra-faible avec un LPA (milieu PALLY) de 500 nM. (K) Image à contraste de phase (à gauche) et coloration par immunofluorescence (à droite) pour OCT4 (jaune), GATA3 (cyan) et GATA4 (magenta) dans un blastoïde cultivé en culture post-implantaire pendant 6 jours. Barre d’échelle: 100 μm. Ce chiffre est adapté de 6,10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig03.jpg"> Figure 3 : Caractérisation de la composition des blastoïdes par séquençage unicellulaire. (A) Analyse groupée non supervisée avec différents paramètres sur UMAP du transcriptome de cellules individuelles dérivées des différents points temporels du blastoïde (24 h, 60 h, 96 h), des hPSC naïfs, des hPSC amorcés et du hTSC (représentent le cytotrophoblaste post-implantation). (B) UMAP du transcriptome de cellules dérivées de blastoïdes (96 h), de CSEh naïfs et de CSEh amorcés intégrés à des ensembles de données publiés provenant d’embryons humains de stades préimplantatoire, périimplantatoire (blastocystes cultivés in vitro) et gastrulation (stade Carnegie 7, c’est-à-dire entre E16 et 19). Les cellules individuelles sont colorées en fonction de leur origine dans les embryons humains (à gauche), les cellules dérivées de blastoïdes ou les cellules souches (au milieu) et le résultat d’une analyse groupée non supervisée (à droite). (C) UMAP du transcriptome de cellules dérivées de blastoïdes, de csah naïfs, de cSEh amorcés et intégrés à un ensemble de données publiées à partir d’embryons au stade de la gastrulation (stade Carnegie 7, c’est-à-dire entre E16 et 19). Les cellules individuelles sont colorées en fonction de leur origine dans les embryons humains (à gauche), les cellules dérivées de blastoïdes ou les cellules souches (au milieu) et le résultat d’une analyse groupée non supervisée (à droite). Ce chiffre est adapté de6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Composition de tous les milieux utilisés dans la présente étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/Supplementary%20Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Un protocole décrivant la formation de blastoïdes humains qui génèrent efficacement, en temps opportun et séquentiellement des cellules de type blastocyste.

Protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

La recherche sur les embryons humains est limitée par leur faible disponibilité et leurs préoccupations éthiques, de sorte que l’obtention de modèles individuels qui reproduisent fidèlement le développement humain précoce soutiendrait le progrès scientifique et médical. La capacité de cette technique à prédire le développement humain dépend de sa capacité à reproduire efficacement les séquences de détermination cellulaire blastocyste et de morphogenèse, en fonction de la séquence et du rythme de développement, et une telle modélisation assurerait la formation de cellules qui reflètent vraiment le stade de blastocyste. À l’avenir, les blastoïdes humains pourraient être utilisés pour identifier des cibles thérapeutiques et contribuer à la modélisation préclinique, par exemple, pour améliorer un milieu de fécondation in vitro ou pour développer des contraceptifs non hormonaux.Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer et Giovanni Sestini feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez et préchaudez les milieux PXGL, les milieux de base N2B27, le tampon de lavage, le PBS et les milieux d’agrégation. Exclure les MEF de la suspension hPSC pour la formation de blastoïdes.Pour l’exclusion meF, préparer une plaque enduite de gélatine en ajoutant un millilitre de 0,1 % de gélatine dans le puits d’une plaque à six puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 à 90 minutes. Pour récolter les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec un millimètre de PBS.Ajouter 500 microlitres de solution de détachement cellulaire à chaque puits d’une plaque de six puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez les cellules au microscope pour suivre la dissociation des colonies en cellules individuelles. Diluer la solution de détachement cellulaire avec un millilitre de tampon de lavage.Prélever les cellules de la plaque en pimentant doucement cinq à 10 fois. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes.Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1,5 millilitre de milieu PXGL dans chaque puits. Ensemencez les cellules sur les plaques recouvertes de gélatine pour l’exclusion MEF et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 60 à 90 minutes. Une fois que les cellules naïves sont ensemencées pour l’exclusion MEF, retirez le PBS de MicroWells et équilibrez les puits avec 200 microlitres de milieu basal N2B27 pour chaque puce MicroWell, et incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.Recueillir le surnageant contenant les cellules naïves non attachées. Transférez-le dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes. Jetez le milieu et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu basal N2B27.Comptez les cellules à l’aide de diapositives de comptage de cellules. Faites tourner les cellules à 200 FCR pendant quatre minutes. Jeter le milieu et ajouter une quantité appropriée de milieu N2B27 contenant 10 micromolaires Y27632 pour obtenir une densité cellulaire de 30 000 cellules pour 50 microlitres.Retirez le support des réseaux MicroWell équilibrés et ajoutez 25 microlitres de supports N2B27 avec 10 micromolaires Y27632. Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de tomber dans le fond du MicroWell. Ajoutez ensuite 125 microlitres de milieu N2B27, complétés par 10 micromolaires Y27632.Dans les 24 heures, des agrégats de CSEh naïfs seront observés sur la puce MicroWell. Initier la formation de blastoïdes en préparant le milieu PALY. Prévassez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Retirez le milieu d’agrégation et ajoutez 200 microlitres de milieu PALY préavertissé aux MicroWells. Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 degrés Celsius. Répétez le changement de média le premier jour.Le deuxième jour, retirez le milieu PALY et ajoutez 200 microlitres de milieu N2B27, complétés par du LPA et 10 micromolaires Y27632. Répétez le changement de média le troisième jour. La formation complète de blastoïdes se produit au quatrième jour.Préparez une suspension naïve de cellules hPSC pour la formation de blastoïdes comme décrit précédemment. Jeter le milieu et ajouter une quantité appropriée de milieu N2B27 contenant 10 micromolaires Y27632 pour obtenir la densité cellulaire de 70 cellules pour 100 microlitres du milieu. Pour regrouper les cellules au fond des puits, centrifuger la plaque à 200 FCR pendant deux minutes à température ambiante.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans des conditions de culture hypoxique. Dans les 24 heures, des agrégats de CSEh naïfs seront observés sur les puits. Ajouter 100 microlitres de milieu PALY fraîchement préparé et préavertissé deux fois.Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, jetez la moitié du support et remplacez-le par 100 microlitres de support PALY préavertis. Répétez l’étape jusqu’au quatrième jour.Préparez une suspension naïve de cellules HPSC pour la formation de troposphère comme décrit précédemment. Une fois que des agrégats de HPSC naïfs se sont formés après 24 heures, échangez le milieu d’agrégation avec PALY sans LIF, complété par trois SC144 micromolaires pour former des trophosphères représentant le trophectoderme précoce. Pour former des trophosphères représentant le trophectoderme mature, échangez le milieu d’agrégation avec PALY, complété par deux XMUMP1 micromolaires.Actualisez le support tous les jours. La formation complète de la trophosphère se produit au quatrième jour. Pour évaluer les états cellulaires, comparez les données transcriptomiques des blastoïdes et des trophosphères avec les témoins appropriés, y compris les cellules souches trophoblastiques humaines de type post-implantation.Les CSEh naïfs cultivés dans le PXGL étaient des structures agrégées et cavitées qui ont émergé entre 48 et 72 heures après l’induction paLY et ont atteint un diamètre de 150 à 250 micromètres en 96 heures. Sur la base de paramètres morphométriques et de la présence des trois lignées, l’efficacité d’induction a atteint 70 à 80% Les trophosphères se sont formées à 50 à 60% d’efficacité dans les 96 heures suivant l’induction. La formation de blastoïdes a été couronnée de succès dans les plaques de 96 puits à fixation ultra faible disponibles dans le commerce dans des conditions d’induction optimisées.La technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire a été utilisée pour caractériser davantage l’état des cellules blastoïdes. Les cellules affichent des profils de clustering nettement reproductibles, quels que soient les paramètres utilisés pour effectuer le clustering et la visualisation des données, ce qui a permis de distinguer les trois lignées de blastocystes en toute confiance. Entre 24 et 60 heures, les cellules souches pluripotentes PXGL forment des analogues de l’épiblaste et du trophectoderme.Ensuite, entre 60 et 96 heures, des analogues du trophectoderme polaire et de l’endoderme primitif se forment. C’est la séquence de spécification au sein du blastocyste, donc les blastoïdes récapitulent la séquence de développement de la spécification de la lignée. La fusion des ensembles de données blastoïdes avec l’ensemble de données de référence des cellules isolées d’embryons à différents stades de développement a montré que 97% des cellules de blastoïdes se regroupaient avec les cellules blastocystes, mais pas avec des cellules d’embryons post-implantation.Une analyse indépendante a confirmé qu’au fil du temps, les cellules souches ont formé des cellules qui correspondaient transcriptionnellement aux cellules d’embryons humains entre le cinquième et le 7,5e jour. C’est en effet le stade de développement au cours duquel le blastocyste humain se forme. Ils ont également confirmé que plus de 95% des cellules dans les blastoïdes ont un transcriptome qui correspond aux trois lignées cellulaires des blastocystes, tandis que 3% des cellules étaient hors cible et appariées avec les stades post-implantation.Il est à noter que nous avons observé que nos cultures 2D initiales comprennent également environ 5% des cellules hors cible. Le stade de développement équivalent peut également être visualisé en examinant les modèles d’expression de marqueurs spécifiques tels que CDX2 pour le trophectoderme blastocyste et PRMD14 pour l’épiblaste blastocyste. La qualité de la culture PXGL initiale est absolument cruciale, et le nombre de cellules dans l’agrégat initial est également critique, et il peut être contrôlé à l’aide de MicroWells.La taille globale de l’agrégat cellulaire après 24 heures devrait être d’environ 50 à 70 micromètres. La formation efficace de blastoïdes de phase complète ouvre la voie à l’étude des processus d’implantation et de développement post-implantation de l’embryon humain.

protocol-for-human-blastoids-modeling-blastocyst-development

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d'entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l'induction de la différenciation en culture.

Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Nous présentons ici un protocole de time-lapse morphométriques pour suivre l’intensité du rétrécissement du blastocyste et re-expansion durant les interventions de previtrification et récupération après réchauffement. L’application du protocole est possible dans les laboratoires in vitro fertilization équipés de microscopes time-lapse et est recommandée dans le développement d’une méthode de vitrification de blastocyste optimale.

Morphométrique protocole pour l’évaluation Objective du comportement de blastocyste pendant la Vitrification et étapes de réchauffement de la planète

La biopsie et la vitrification de Blastocyst sont nécessaires pour mener efficacement le test génétique préimplantatoire. Une approche impliquant l'ouverture séquentielle de la pellucida de zona et la récupération de 7-8 cellules de trophectoderm dans le jour 5-7 post-insémination limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales.

Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Ce protocole décrit des méthodologies permettant d’établir un modèle in vitro simple et efficace d’implantation embryonnaire pour évaluer les molécules pertinentes affectant le processus d’implantation embryonnaire.

Etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro

Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple pour effectuer une analyse Evans Blue Dye (EBD) sur des larves de poisson-zèbre.  Cette technique est un outil puissant pour la caractérisation de l’intégrité des muscles squelettiques et la délimitation des modèles de dystrophie musculaire chez le poisson-zèbre, et constitue une méthode précieuse pour le développement de nouvelles thérapies.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

La technologie des microréseaux permet une mesure quantitative et un profilage de l’expression génique des transcrits à l’échelle du génome. Par conséquent, ce protocole fournit une procédure technique optimisée dans un réseau bovin bicolore fabriqué sur mesure à partir d’embryons de bovins du jour 7 pour démontrer la faisabilité de l’utilisation d’une faible quantité d’ARN total.

Transcriptome profilage des In-Vivo embryons de bovins pré-implantation à l'aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Ici, nous présentons un protocole qui a provoqué la réactivité du cortisol chez un adolescent vulnérable, un échantillon mexicain utilisant une version modifiée du Trèves Social Stress Test (TSST). Les échantillons de salive ont été prélevés au début, 15, 30 et 45 min après l'apparition du TSST. Les recherches futures pourraient utiliser ce TSST modifié avec des jeunes vulnérables.

Un test de stress social modifié de Trèves pour les adolescents mexicains mexicains vulnérables

Découvrez un protocole de formation de blastoïdes humains à partir de cellules souches pluripotentes naïves. Cette technique reproduit fidèlement le stade blastocyste avec une efficacité de 70 à 80 %.

Protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains

Explorer plus de vidéos