Détermination de la distribution de la longueur de la chaîne de glucane du glycogène à l’aide de la méthode d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE)

Cette méthode permet de mieux comprendre les organisations structurelles des particules de glycogène. C’est une question importante car la population des chaînes de glucane, appelée distribution de longueur de chaîne, détermine les propriétés physico-chimiques des particules de glycogène. Comme la solubilité dans l’eau.

Un avantage majeur de cette technique est que la fluorescence est constante quelle que soit la longueur de la chaîne glucane. Il n’y a qu’une seule molécule APTS liée par le glucane. Ainsi, l’intensité de fluorescence est directement proportionnelle au nombre de chaînes glucanes.

Le domaine de l’électrophorèse capillaire assistée est adapté à la résolution du mécanisme médical des enzymes métabolisant le glycogène. Par exemple, nous pouvons déterminer le degré de polymérisation des chaînes de glucane transférées par des enzymes ramifiées sur du glucane accepté. La réaction doit être effectuée dans des conditions.

Par conséquent, les régions doivent être protégées de l’humidité. Mélanger 200 microlitres de 0,5-2 milligrammes par millilitre de glycogène purifié avec 200 microlitres de 100 tampons d’acétate de pH 4,8. Ajouter 2 microlitres d’isoamylase et 1,5 microlitres de pullulanase.

Mélanger doucement en pipetant de haut en bas. Ensuite, incubez à 42 degrés Celsius pendant 16 heures dans un tube de 1,5 millilitre. Arrêtez les réactions en incubant à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Centrifuger à 16, 100 fois G’for 5 minutes à température ambiante pour granuler et enlever tout matériau insoluble. Retirez le super entretien avec une pipette et transférez-les dans de nouveaux tubes annotés. Après avoir ajouté des billes de résine dans un tube de micro-fuge vide, dessalez les surnageants en ajoutant l’équivalent de 100 microlitres d’une perle de résine échangeuse d’anions et agitez.

Prélever les échantillons par pipetage et les placer dans de nouveaux tubes annotés. Lyophiliser les échantillons. Conservez les échantillons séchés à température ambiante ou à 20 degrés Celsius.

Mélanger les échantillons séchés avec 2 microlitres de 1 cyanoborohydrure de sodium molaire et de tétrahydrofurane, et 2 microlitres d’acide trisulfonique 8 amino 1-3-6 pyrène. Incuber à 42 degrés Celsius pendant 16 heures dans l’obscurité. Ajoutez 46 microlitres d’eau ultra pure à chaque échantillon.

Pour diluer les échantillons 50 fois, ajoutez un microlitre de l’échantillon à 49 microlitres d’eau ultra pure dans 100 microlitres microviaux. En vortex pour bien mélanger. Placez les échantillons dans l’obscurité pendant 5 à 10 minutes tout en réglant le visage.

Pour effectuer une électrophorèse à polarité inversée, configurez la méthode, réglez la pression d’injection à 0,5 livre de force par pouce carré. Réglez ensuite la polarité sur le mode inverse pour la séparation. Diluer le tampon de séparation des glucides lié à l’azote à un tiers dans de l’eau ultra pure.

Effectuer la séparation des glucanes marquée APTS dans le tampon dilué à 30 kilovolts dans un capillaire de silice fondue nue. Ensuite, configurez le temps d’injection et commencez l’analyse. Exportez les fichiers ASC et CDF contenant respectivement le profil d’électrophérogramme et les données d’intégration.

Ouvrez le fichier ASC et dessinez l’unité de fluorescence relative en fonction du graphique temporel. Ouvrez le fichier CDF. Procédez à une première intégration automatique et ajustez les paramètres suivants avec l’intégration de vallée à vallée et la superficie minimale.

Vérifiez et corrigez manuellement tout événement d’intégration incorrect. Les signaux de fluorescence observés entre 4,13 et 4,67 minutes provenaient de l’APTS non réagi. Le temps aléoutien du Maltohexaose DP 6 étiqueté a été estimé à 8,49 minutes.

Les glucanes de glycogène bovin marqués APTS ont été identifiés sur la base de l’époque aléoutienne de DP 6. Aucune trace de maltooligosaccharide libre n’a été détectée dans l’échantillon témoin dans lequel le glycogène n’a pas été incubé avec des enzymes débranchantes. Le panneau en médaillon montre une séparation des chaînes glucanes jusqu’à 44 DP. La distribution de la longueur de la chaîne est indiquée sous la forme du pourcentage de DP pour chaque DP. La longueur moyenne de la chaîne a été calculée en additionnant chaque pourcentage de fois la chaîne Le degré de polymérisation correspondant.

L’analyse faciale a montré que les glucanes les plus abondants sont le maltose et le foie de lapin, le maltohexaose dans l’huître et le maltoheptaose dans le foie bovin. Les distributions de longueur de chaîne du glycogène purifié à partir de souches bactériennes cyanobactériennes de type sauvage et mutantes ont été déterminées à l’aide d’une analyse faciale. Des analyses soustractives ont été effectuées en soustrayant le pourcentage de chaque PDD de type sauvage du pourcentage de chaque PDD de mutants.

Les distributions moyennes de la longueur de la chaîne du glycogène de type sauvage et des mutants de Synechocystis ont été normalisées en fonction du pic maximal observé pour chaque CLD. Cette technique permet de mieux comprendre les maladies humaines associées à un défaut du métabolisme du glycogène, en particulier la maladie d’Andersen, riche en résultats de l’accumulation de particules de glycogène anormales dans les cellules.