Name: Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez le séquençage d'ARN à noyau unique par gouttelettes pour caractériser les neurones cardiaques sympathiques de souris. Cette méthode permet le multiplexage par anticorps à code-barres et l'analyse de l'architecture neuronale.

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Nous remercions Susan L. Kloet (Département de génétique humaine, LUMC, Leiden, Pays-Bas) pour son aide dans la conception expérimentale et ses discussions utiles. Nous remercions Emile J. de Meijer (Département de génétique humaine, LUMC, Leiden, Pays-Bas) pour son aide à l’isolement de l’ARN mononuclé et à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage. Ce travail est soutenu par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) [016.196.346 à M.R.M.J.].

Ce protocole décrit toutes les étapes requises pour le séquençage de l’ARNn des ganglions murins cervicaux et/ou cervicothoraciques (stellaires). Des souris femelles et mâles C57BL/6J (âgées de 15 semaines, n = 2 pour chaque sexe) ont été utilisées. Une souris Wnt1-Cre;mT/mG supplémentaire a été utilisée pour visualiser les ganglions à des fins de dissection17,18. Cette souris supplémentaire a été générée par le croisement d’une souris B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J et d’une souris B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les NIH et approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Université de Leiden (numéro de licence AVD1160020185325, Leiden, Pays-Bas). Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels et animaux utilisés dans le protocole.
1. Préparatifs
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées dans une armoire de flux de culture cellulaire.
<ol><li>Nettoyez les pinces et les ciseaux en immergeant les instruments dans de l’éthanol à 70% pendant 20 min.</li>
	<li>Préparer le milieu ganglionnaire composé de milieu neurobasal complété par B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) et 1% antibiotique-antimycotique. Préchauffer le milieu ganglionnaire à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution de digestion : 0,25 % de trypsine-EDTA (1:1) et 1 400 U/mL de collagénase de type 2 dissous dans le milieu ganglionnaire.</li>
	<li>Préparer un tampon de lavage cellulaire frais et froid (4 °C) (0,4 % d’albumine sérique bovine [BSA]) et un tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2 et 0,1 % de détergent non ionique, 40 U/mL d’ARNase dans de l’eau sans nucléase) pour l’isolement du noyau.</li>
	<li>Préparer un tampon de lavage du noyau (1x solution saline tamponnée au phosphate [PBS] avec 2,0 % de BSA et 0,2U/μL d’inhibiteur de la RNase).</li>
	<li>Préparer le tampon de coloration ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2 % BSA, 0,02 % Tween-20 dans de l’eau sans nucléase).</li>
</ol>2. Dissection des ganglions cervicaux supérieurs de souris adultes (SCG)
<ol><li>Euthanasiez les souris et gardez-les sur la glace. NOTE: Dans la présente étude, un total de 4 souris C57BL6 / J ont été euthanasiées par asphyxie au CO2 . Alternativement, l’isoflurane peut être utilisé suivi d’une exsanguination lorsqu’une grande quantité de sang doit être collectée à d’autres fins d’étude.</li>
	<li>Fixez la souris sur une planche de dissection avec des broches et arrosez-la d’éthanol à 70% pour minimiser la dispersion de la fourrure (le rasage n’est pas nécessaire).</li>
	<li>Sous un stéréomicroscope, ouvrez la peau de la région du cou en faisant une coupe médiane avec des ciseaux, écartez les glandes sous-maxillaires et retirez le muscle sternomastoïde pour exposer et localiser l’artère carotide commune et sa bifurcation (Figure 1A, B, voir flèche).</li>
	<li>Disséquez la bifurcation de l’artère carotide droite et gauche et le tissu qui y est attaché. Transférer chaque morceau de tissu disséqué dans une boîte de Petri séparée de 3,5 cm contenant du PBS froid.</li>
	<li>Recherchez le SCG attaché à la bifurcation carotidienne. Nettoyez davantage le SCG en retirant l’artère et d’autres tissus attachés dans la boîte de Pétri (Figure 1E).</li>
</ol>3. Dissection des ganglions stellaires de souris adultes (StG)
<ol><li>Pour disséquer le StG, faites une coupe médiane dans l’abdomen, suivie de l’ouverture du diaphragme et de la paroi thoracique ventrale.</li>
	<li>Retirez le cœur et les poumons pour exposer le thorax dorsal. Recherchez le StG antérolatéral gauche et droit au musculus colli longus (LCM) au niveau de la première côte (Figure 1C, D, indiqué par des lignes pointillées).</li>
	<li>Disséquez les StG gauche et droit avec des pinces et transférez-les séparément dans des boîtes de Petri de 3,5 cm contenant du PBS froid (Figure 1F). ​</li>
</ol>4. Isolement et cryoconservation des cellules ganglionnaires de souris
Les étapes 4 à 6 sont résumées à la figure 2.
<ol><li>Transférez soigneusement tous les SCG et StG individuels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL séparés à l’aide de pinces. REMARQUE: N’utilisez pas d’embouts de pipette pour transférer les ganglions, car les ganglions sont enclins à adhérer à la paroi des embouts de pipette en plastique.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 40 min. REMARQUE: Cette étape vise à faciliter la digestion et la libération cellulaire ci-après dans la solution de collagénase de type 2.</li>
	<li>Préparer un tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu ganglionnaire pour chaque échantillon. Laissez les ganglions s’installer au fond des tubes de microcentrifugation. Recueillir le surnageant, qui contient très peu de cellules ganglionnaires, transférer le surnageant dans les tubes préparés de 15 mL et étiqueter chaque tube. Alternativement, pour gagner du temps, aspirer le surnageant trypsine-EDTA sans prélèvement car très peu de cellules dissociées peuvent y être détectées. REMARQUE: Une petite quantité de solution de trypsine-EDTA (~ 10-30 μL) peut être laissée dans le tube de microcentrifugation pour éviter l’élimination des ganglions. Évitez le pipetage à cette étape, car il pourrait endommager les ganglions et entraîner un faible rendement de cellules ganglionnaires par la suite.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de solution de collagénase de type 2 dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 35-40 min. Essayez de remettre le ganglion en suspension après 35 minutes; si le ganglion est encore intact et ne se dissocie pas, prolongez le temps d’incubation ou augmentez la concentration de solution de collagénase de type 2 si nécessaire. REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier en fonction de la taille du ganglion.</li>
	<li>Resuspendez les ganglions dans une solution de collagénase en pipetant de haut en bas ~ 10 fois ou jusqu’à ce que les amas de tissus ne soient plus détectés.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL précédemment utilisé qui contient le milieu de culture des ganglions et la suspension de trypsine-EDTA du même ganglion. Faites tourner la suspension de la cellule avec une centrifugeuse à rotor à godet oscillant pendant 10 min, 300 × g à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant cellulaire. REMARQUE: Parce que les cellules ganglionnaires sont dissociées d’un seul ganglion, la pastille cellulaire peut être trop petite pour être détectée à l’œil nu; une petite quantité de surnageant peut être laissée dans le tube pour éviter l’enlèvement accidentel de la pastille de cellule.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules ganglionnaires dans 270 μL de sérum fœtal bovin (FBS, faible endotoxine) et transférer chaque suspension cellulaire-FBS dans un cryoviral de 1 mL.</li>
	<li>Pour compter les cellules, mélanger 5 μL de la suspension de cellules ganglionnaires avec 5 μL de colorant bleu trypan à 0,4% et charger le mélange dans un hémocytomètre. Comptez le nombre total et le nombre de cellules vivantes au microscope. REMARQUE: La viabilité cellulaire (nombre de cellules vivantes / nombre total de cellules = viabilité %) est généralement supérieure à 90% avec ce protocole de dissociation. Le nombre de cellules vivantes d’un seul ganglion (SCG ou StG) se situe généralement entre 9 000 et 60 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque suspension cellulaire-FBS dans les cryoviales, bien mélanger et transférer les cryoviales dans un récipient de congélation cellulaire, qui est maintenu à température ambiante. Conservez le récipient chargé de cryovial à -80 °C pendant la nuit et transférez les cryoviaux dans de l’azote liquide le lendemain pour une conservation prolongée avant le séquençage.</li>
</ol>5. Isolement du noyau
REMARQUE: Le SCG gauche et droit isolé à partir de quatre souris (au total 8 échantillons) a été utilisé comme exemple dans la préparation suivante de l’isolement et du séquençage du noyau. Gardez tout sur la glace pendant toute la procédure. En raison de l’invisibilité des petites pastilles de noyau, une centrifugeuse avec des seaux oscillants est fortement recommandée pour faciliter l’élimination des surnageants tout au long de la procédure.
<ol><li>Préparer des tubes de 15 mL avec une passoire (30 μm) sur le dessus et précuire la passoire avec 1 mL du milieu ganglionnaire.</li>
	<li>Retirez les cryoviaux de l’azote liquide et décongelez-les immédiatement au bain-marie à 37 °C. Lorsqu’un petit boulet de glace est laissé dans le cryovial, sortez les cryoviales du bain-marie.</li>
	<li>Récupérez les cellules ganglionnaires en laissant tomber 1 mL du milieu ganglionnaire dans chaque cryovial tout en secouant soigneusement à la main. Facultatif : Pour évaluer la récupération cellulaire, mélanger la suspension cellulaire après la récupération et prélever 5 μL de suspension cellulaire pour le comptage des cellules vivantes, comme décrit à l’étape 4.8.</li>
	<li>Charger chaque suspension de cellules ganglionnaires sur une passoire séparée (préparée à l’étape 5.1) et rincer chaque passoire avec 4-5 mL de milieu ganglionnaire.</li>
	<li>Centrifuger la suspension de cellule tendue pendant 5 min à 300 × g, retirer soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon de lavage cellulaire.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation à faible liaison ADN/ARN de 0,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez 45 μL du surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille de cellule.</li>
	<li>Ajouter 45 μL de tampon de lyse réfrigéré et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 8 min sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de tampon de lavage à noyau froid à chaque tube. Ne pas mélanger.
</li>
	<li>Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer 95 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.</li>
	<li>Ajouter 45 μL de tampon de lavage de noyau réfrigéré à la pastille. Facultatif: Prendre 5 μL de suspension de noyau, mélanger avec 5 μL de 0,4% de bleu de trypan pour compter, et vérifier la qualité des noyaux au microscope avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez le surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.</li>
</ol>6. Codage à barres du noyau avec hashtag oligos (HTOs) et multiplexage
REMARQUE: Les étapes de coloration HTO ont été modifiées et optimisées pour le marquage nucléaire de très faibles quantités de noyaux (ganglionnaires) selon l’application précédente dans le tissu cortical par Gaublomme et al.15.
<ol><li>Ajouter 50 μL de tampon ST-SB à la pastille du noyau, pipeter doucement 8 à 10 fois jusqu’à ce que les noyaux soient complètement remis en suspension.</li>
	<li>Ajouter 5 μL de réactif Fc Blocking par 50 μL du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 10 min sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 1 μL (0,5 μg) d’anticorps hashtag mononuclé par tube du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 30 min sur de la glace. REMARQUE: Un temps d’incubation plus court entraîne une baisse de l’efficacité de l’étiquetage des hashtags, comme le démontrent les résultats représentatifs.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de ST-SB à chaque tube. Ne pas mélanger.
</li>
	<li>Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min, 600 × g à 4 °C.</li>
	<li>Retirer 145 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.4 et 6.5. Retirez le surnageant autant que possible sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille du noyau dans 50 μL de ST-SB et mélanger doucement les noyaux.</li>
	<li>Prenez 5 μL de la suspension du noyau et mélangez-la avec 5 μL de bleu de trypan à 0,4% pour compter les noyaux au microscope. Voir la figure 3A pour une image représentative de noyaux mélangés à du bleu de trypan et chargés dans un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min à 600 × g à 4 °C.</li>
	<li>Remettre en suspension les noyaux dans ST-SB pour atteindre une concentration cible de noyaux de 1 000 à 3 000 noyaux/μL pour chaque échantillon en fonction du nombre de noyaux correspondant.</li>
	<li>Regroupez les échantillons pour obtenir le nombre de cellules souhaité. REMARQUE: Par exemple, dans cette expérience, 8 échantillons ont été également regroupés pour atteindre un total de 25 000 noyaux pour passer immédiatement à 10x Genomics Chromium et snRNA-seq par la suite. Le nombre de noyaux se situe généralement entre 6 000 et 40 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines. Seulement environ la moitié des noyaux chargés totaux peuvent être capturés par snRNA-seq à base de gouttelettes. Par exemple, un mélange de 25 000 noyaux a été préparé pour assurer la capture de 10 000 noyaux, ce qui est nécessaire pour la préparation et le séquençage ultérieurs de la bibliothèque.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ici, un protocole détaillé est décrit qui se concentre sur i) la dissection des ganglions cervicaux et sympathiques stellaires supérieurs de souris adultes, ii) l’isolement et la cryoconservation des cellules ganglionnaires, iii) l’isolement du noyau et iv) le codage à barres du noyau avec marquage HTO à des fins de multiplexage et de séquençage de l’ARNN.
Avec ce protocole, les cellules ganglionnaires sympathiques peuvent facilement être obtenues en dissociant les ganglions individuels à l’ai...

Le système nerveux autonome (SNA) est une partie cruciale du système nerveux périphérique qui maintient l’homéostasie du corps, y compris l’adaptation aux conditions environnementales et à la pathologie1. Il est impliqué dans la régulation de plusieurs systèmes d’organes dans tout le corps tels que les systèmes cardiovasculaire, respiratoire, digestif et endocrinien. Le SNA est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Les branches vertébrales du système nerveux sympathique synapsent dans les ganglions de la chaîne sympathique, situés bilatéralement en position paravertébrale. Les ganglions cervicaux et thoraciques bilatéraux, en particulier la StG, sont des composants importants participant à l’innervation sympathique cardiaque. Dans les états pathologiques, tels que l’ischémie cardiaque, un remodelage neuronal peut se produire, entraînant une surenchère sympathique2. Le remodelage neuronal a été démontré dans de multiples études histologiques chez l’homme et plusieurs autres espèces animales 3,4,5,6. Une caractérisation biologique détaillée du remodelage neuronal induit par l’ischémie cardiaque dans les ganglions sympathiques cardiaques fait actuellement défaut, et les caractéristiques biologiques fondamentales des types ou sous-types de cellules neuronales spécialisées dans le système nerveux sympathique cardiaque (SNS) ne sont pas encore entièrement déterminées dans la santé et la maladie7.
De nouvelles technologies, telles que scRNA-seq, ont ouvert des portes pour la caractérisation génétique de petits tissus au niveau 8,9 d’une seule cellule. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation optimisée de ces techniques unicellulaires chez l’homme10. En outre, le séquençage unicellulaire nécessite un débit élevé de cellules pour récupérer un nombre suffisant de cellules en raison d’une perte élevée dans le processus de séquençage. Cela peut s’avérer difficile lors de l’étude de petits tissus difficiles à capturer en une seule session et nécessitant plusieurs échantillons pour introduire suffisamment de cellules uniques pour le séquençage. La technologie snRNA-seq à base de gouttelettes récemment développée (c’est-à-dire la plate-forme 10x Chromium) permet d’étudier les différences biologiques entre les noyaux simples11,12. snRNA-seq détient un avantage sur scRNA-seq pour les grandes cellules (>30 μm), qui peuvent ne pas être capturés dans Gel Bead in Emulsions (GEM), ainsi qu’une compatibilité améliorée avec une dissociation étendue et / ou une conservation prolongée 13,14,15.
L’hétérogénéité, le nombre de cellules neuronales et d’autres cellules enrichies dans le SNS cardiaque sont des aspects importants pour la caractérisation du SNA dans les états de santé et de maladie. De plus, l’innervation spécifique à un organe ou à une région par chaque ganglion sympathique contribue à la complexité du SNS. De plus, il a été démontré que les ganglions cervicaux, stellaires et thoraciques de la chaîne sympathique innervent différentes régions du cœur16. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer une analyse mononucléaire des cellules ganglionnaires dérivées de ganglions individuels pour étudier leur architecture biologique.
Le snRNA-seq à base de gouttelettes permet un profilage d’expression à l’échelle du transcriptome pour un pool de milliers de cellules provenant de plusieurs échantillons à la fois avec des coûts inférieurs à ceux des plates-formes de séquençage sur plaques. Cette approche permet aux snRNA-seq à base de gouttelettes d’être plus adaptés à la classification du phénotype cellulaire et à l’identification de nouvelles sous-populations de cellules au sein du SCG et du StG. Notamment, ce protocole fournit une approche concise par étapes pour l’identification, l’isolement et le séquençage de l’ARN mononuclé des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une large application dans les études de la caractérisation des ganglions innervant d’autres organes et tissus apparentés dans la santé et la maladie.

<table><tbody><tr><td><fort>Produits chimiques et réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % colorant bleu trypan</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>utiliser 1 400 U/mL</td></tr><tr><td>de sulfoxyde de diméthyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolu &ge ; 99.5 %</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (faible teneur en endotoxine)</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Tampon de lavage cellulaire</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Tampon de lavage</td></tr> cellulaire <tr><td>Solution de chlorure de magnésium, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Tampon de lyse de noyau</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitut (détergent non ionique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Tampon de lyse de noyau</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase (non traitée DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>Tampon</td></tr> <tr><td>de lyse de noyauInhibiteur protecteur de la RNase, 40 U/&micro ; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Tampon de lyse du noyau</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de sodium, 5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>Tampon de lyse du noyau</td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>Tampon de lyse du noyau</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine 10 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Lavage du noyau</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Nucleus</td></tr><tr><td>wash Protecteur inhibiteur de RNase, 40 U/&micro ; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Nucleus wash</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST tampon de coloration (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de calcium, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Tampon de coloration ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de magnésium, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST tampon (ST-SB)</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases (non DEPC traité)</td>Tampon de coloration <td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de sodium, 5M</td> Tampon de coloration <td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma, 1M, pH 7,4</td> Tampon de coloration <td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr>Tampon de coloration <td>Tween-20</td><td>Merck Millipore</td><td>822184</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 Protéines du complexe des pores antinucléaires Hashtag 1 Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>682205</td><td>Hashtag Anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 Protéines du complexe des pores antinucléaires Hashtag 2 Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>682207</td><td>Hashtag Anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 Protéines du complexe des pores antinucléaires Hashtag 3</td><td>Biolegend</td><td>682209</td><td>Hashtag anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0461 Protéines complexes de pores antinucléaires Hashtag 11</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>682225</td><td>Hashtag anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 Protéines complexes de pores antinucléaires Hashtag 12</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>682227</td><td>Hashtag anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 Protéines complexes de pores antinucléaires Hashtag 13</td><td>Biolegend</td><td>d’anticorps 682229</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 Protéines du complexe des pores antinucléaires Hashtag 14</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>682231</td><td>Hashtag anticorps</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0465 Protéines du complexe des pores antinucléaires Hashtag 15</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>682233</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>anticorps TruStain FcX (humain)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Solution de blocage des récepteurs FC</td></tr><tr><td><fort>Équipement et consommables</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligne claire&nbsp ; Hémacytomètre</td><td>Merck</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp ; </td><td></td>EP022629905</tr><tr><td>CoolCell LX Conteneur de congélation de cellules</td><td>Corning</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Scientific</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0,5 mL Tube Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Boîte de Pétri non traitée</td> TC <td>Corning</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Fisher</td><td>scientific 10773501</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins renforcés</td><td>Outils pour les sciences</td><td>fines 14091-09</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Bac à glace, rectangulaire 4 L Orange</td><td>Corning</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Moria MC50 Ciseaux</td><td>pour les sciences fines</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Ciseaux à ressort</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CK2 ULWCD</td><td>Microscope Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de préséparation (30 &micro ; m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>Miltenyi biotec130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau agitateur</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de silicone</td><td>RubberBV</td><td>3530</td><td>Carte de dissection</td></tr><tr><td>Logiciels et progiciels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell ranger</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programmation R</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sudio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverse</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. souris Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J Souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX stock #022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Souris Luo/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX stock #007576</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J souris</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Code pour l’analyse des données</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</tr></tbody></table>

isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’arn à noyau unique

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Le système nerveux autonome cardiaque est crucial dans le contrôle de la fonction cardiaque, comme la fréquence cardiaque et la contractilité cardiaque, et est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Normalement, il y a un équilibre entre ces deux branches pour maintenir l’homéostasie. Cependant, les états pathologiques cardiaques tels que l’infarctus du myocarde, l’insuffisance cardiaque et l’hypertension peuvent induire le remodelage des cellules impliquées dans l’innervation cardiaque, ce qui est associé à un résultat clinique défavorable.
Bien qu’il existe de grandes quantités de données sur la structure histologique et la fonction du système nerveux autonome cardiaque, son architecture biologique moléculaire dans la santé et la maladie est encore énigmatique à bien des égards. De nouvelles technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) sont prometteuses pour la caractérisation génétique des tissus à résolution unicellulaire. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation standardisée de ces techniques. Ici, ce protocole exploite le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes (snRNA-seq), une méthode pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Une approche par étapes est démontrée pour effectuer la séquence d’ARNN des ganglions cervicaux supérieurs bilatéraux (SCG) et stellaires (StG) disséqués à partir de souris adultes.
Cette méthode permet la conservation à long terme des échantillons, en maintenant une qualité d’ARN adéquate lorsque les échantillons de plusieurs individus / expériences ne peuvent pas être collectés tous en même temps dans un court laps de temps. Le codage à barres des noyaux avec des oligos de hashtag (HTO) permet de démultiplexer et de retracer des échantillons ganglionnaires distincts après le séquençage. Des analyses ultérieures ont révélé une capture réussie des noyaux des cellules neuronales, gliales satellites et endothéliales des ganglions sympathiques, validée par snRNA-seq. En résumé, ce protocole fournit une approche par étapes pour l’ARNN-seq des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une application plus large dans les études de l’innervation d’autres organes et tissus.

Analyse du contrôle de la qualité de la préparation de la bibliothèque d’ADNc à noyau unique et de la formation d’ARNN Les résultats représentatifs décrivent les résultats de séquençage de 10 000 noyaux capturés dans un seul pool avec une bibliothèque de 25 000 lectures/expression génique du noyau et une bibliothèque de hashtags de 5 000 lectures/noyau. La figure 3B illustre les résultats du contrôle de la qualité de la bibliothèque d’ADNc, d’expression génique (GEX) et d...

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

Dans ce protocole JoVE, nous utilisons le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Cette méthode permet le séquençage d’une grande collection d’échantillons neuronaux sur une période de temps. En tirant des noyaux à code-barres avec des oligos hashtag, cette méthode permet le multiplexage des échantillons.Cette méthode a le potentiel d’être étendue au séquençage des neurones des ganglions humains, ce qui a été difficile en raison de sa grande taille cellulaire et de la collecte simultanée difficile d’échantillons. Conny van Munsteren, technicienne de recherche, et Lieke van Roon, doctorante de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure En commençant par collecter tous les matériaux nécessaires à la dissection, puis en fixant la souris sur la carte de dissection. Mouiller la souris avec de l’éthanol à 70% pour minimiser la dispersion de la fourrure.Ouvrez la peau de la région du cou en faisant une coupe médiane avec des ciseaux. Sous un stéréomicroscope, déplacez les glandes sous-mandibulaires de côté et retirez le muscle mastoïdien sternal pour exposer l’artère carotide commune et sa bifurcation, ainsi que les ganglions cervicaux supérieurs et retirez le tissu qui y est attaché. Disséquez la bifurcation de l’artère carotide droite et gauche et le tissu qui y est attaché.Transférer chaque morceau de tissu disséqué dans une boîte de Petri séparée de 3,5 centimètres contenant du PBS froid. Localisez les ganglions cervicaux supérieurs attachés à la bifurcation carotidienne. Nettoyez les ganglions cervicaux supérieurs en enlevant l’artère et le tissu attaché.Pour disséquer les ganglions étoilés, faites une coupe médiane dans l’abdomen, suivie de l’ouverture du diaphragme et de la paroi thoracique ventrale. Retirez les poumons, suivis du cœur, pour exposer le thorax dorsal. Au niveau de la première côte, localisez les ganglions étoilés gauche et droit antérolatéral au musculus colli longus.Disséquez les deux ganglions stellaires avec une pince en enlevant le tissu environnant. Transférez-les dans des boîtes de Petri de 3,5 centimètres contenant du PBS froid. À l’aide de pinces, transférer les ganglions cervicaux supérieurs et les ganglions stellaires pour séparer des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis ajouter 500 microlitres de solution de trypsine-EDTA à 0,25% à chaque tube et incuber dans un bain-marie agité.Laissez les ganglions se déposer au fond des tubes de microcentrifugation. Transférer le surnageant dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu ganglionnaire. Aux tubes de microcentrifugation, ajouter 500 microlitres de solution de collagénase de type 2 et incuber dans un bain-marie agité.Après l’incubation, remettre les ganglions dans une solution de collagénase en pipetant jusqu’à ce que les amas de tissus ne soient plus détectés. Transférer la suspension cellulaire dans le tube de 15 millilitres précédemment utilisé contenant le milieu de culture des ganglions avec la suspension de trypsine-EDTA. Centrifugez la suspension de la cellule et jetez le surnageant de la cellule.Remettre en suspension la pastille dans 270 microlitres de sérum fœtal bovin et la transférer dans un cryovial de 1 millilitre. Pour compter les cellules, mélanger 5 microlitres de la suspension de cellules ganglionnaires avec cinq microlitres de colorant bleu trypan à 0,4%. Chargez le mélange dans un hémocytomètre et comptez le nombre total et le nombre de cellules vivantes au microscope.Ensuite, ajoutez 30 microlitres de diméthylsulfoxyde à chaque cryovial et mélangez bien. Transférez les cryoviales dans un récipient de congélation cellulaire et placez-le à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez des tubes de 15 millilitres avec une crépine de 30 micromètres sur le dessus.Pré-rincer la passoire avec 1 millilitre de milieu ganglionnaire. Retirez les cryoviaux de l’azote liquide et décongelez-les immédiatement au bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une petite pastille de glace soit laissée dans le cryovial. Ajouter 1 millilitre du milieu ganglionnaire dans chaque cryovial tout en secouant soigneusement le flacon pour récupérer les cellules ganglionnaires.Chargez la suspension de cellules ganglionnaires sur la passoire et rincez avec 4 à 5 millilitres de milieu ganglionnaire. Centrifugez la suspension de cellule tendue. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage cellulaire.Transférer la suspension de la cellule dans un tube de microcentrifugation à faible liaison de 0,5 millilitre. Centrifuger la suspension de la cellule. Une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant est désormais indispensable.Après centrifugation, retirer 45 microlitres du surnageant sans déloger la pastille cellulaire. Ajouter 45 microlitres de tampon de lyse réfrigéré, doucement mélangés par pipetage, et incuber les cellules pendant 8 minutes sur de la glace, puis ajouter 50 microlitres de tampon de lavage à noyaux froids à chaque tube. Centrifugez la suspension des noyaux et retirez 95 microlitres du surnageant sans perturber la pastille de noyau.Ajouter 45 microlitres de tampon de lavage des noyaux réfrigérés à la pastille, répéter la centrifugation et retirer le surnageant. À la pastille de noyau, ajoutez 50 microlitres de ST-SB et pipetez doucement jusqu’à ce que les noyaux soient complètement remis en suspension, puis ajoutez 5 microlitres de réactif bloquant FC et incubez pendant 10 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez 1 microlitre d’anticorps hashtag mono-noyau et incubez pendant 30 minutes sur de la glace.Après l’incubation, ajoutez 100 microlitres de ST-SB à chaque tube. Centrifugez la suspension et retirez 145 microlitres du surnageant sans perturber la pastille de noyau. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant.Remettre en suspension la pastille de noyau dans 50 microlitres de ST-SB et mélanger doucement. Prenez 5 microlitres de la suspension de noyaux et mélangez-les avec 5 microlitres de bleu de trypan à 0,4% pour compter les noyaux au microscope. Encore une fois, centrifugez la suspension des noyaux et remettez en suspension la pastille de noyaux dans ST-SB pour atteindre une concentration cible de noyaux de 1 000 à 3 000 noyaux par microlitre.Tirez les échantillons pour obtenir le nombre de cellules souhaité. L’analyse du contrôle de la qualité pour la préparation de la bibliothèque a montré des ADNc oligo-dérivés de hashtags inférieurs à 180 paires de bases. Un large pic de 300 à 1 000 paires de bases représentait une bibliothèque d’expression génique de haute qualité, tandis qu’un pic spécifique de 194 paires de bases montrait la bibliothèque oligo de hashtags.L’analyse du séquençage de l’ARN à noyau unique a révélé que 12 grappes ont été visualisées par UMAP et que des anticorps hashtag ont été distribués entre toutes les grappes. L’étiquetage spécifique par hashtag oligos a été confirmé par l’expression de Xist. Les hashtags 1 à 4 ont étiqueté les échantillons féminins, tandis que 5 à 8 ont étiqueté les échantillons masculins.La qualité et la résolution des données de séquençage ont été vérifiées par des transcriptions clés telles que TH, DBH et SNAP25 dans les groupes 5 et 7 pour les neurones sympathiques, S100B dans les groupes 0 à 3 pour les cellules gliales satellites, PECAM 1 dans le groupe 4 pour les cellules endothéliales et ACTA2 dans le groupe 8 pour les cellules stromales. Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de se rappeler que la préparation appropriée et un équipement adéquat tel que des ciseaux à dissection fine, des pinces à épiler pointues et une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant sont essentiels. L’approche par étapes pour le séquençage de l’ARN mononuclé des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques a le potentiel d’une large application dans la caractérisation des ganglions innervant d’autres organes et tissus apparentés dans la santé et la maladie.

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Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.

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L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

L’hétérogénéité intratumorale est une caractéristique inhérente aux tumeurs, y compris les gliomes. Nous avons développé un protocole simple et efficace qui utilise une combinaison de tampons et de centrifugation par gradient pour isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome frais congelés pour des études de séquençage de l’ARN à noyau unique et de l’ATAC.

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

Ici, nous présentons un protocole pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de reins de souris congelés qui améliorent la représentation des types de cellules rénales médullaires et évitent les artefacts d’expression génique de la dissociation des tissus enzymatiques.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les noyaux des tissus hépatiques archivés surgelés pour le séquençage de l’ARN mononoyau, le séquençage ATAC et la multiomique articulaire (RNA-seq et ATAC-seq).

Isolement de noyaux de tissu hépatique surgelé pour la multiomique unicellulaire

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.

Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau

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Isolement de noyaux à partir de tissu adipeux intermusculaire humain et séquençage d’ARN à noyaux uniques en aval

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Un modèle de Disturbed flux athérosclérose induite chez la souris artère carotide par ligature partielle et une méthode simple d&#39;isolement d&#39;ARN de l&#39;endothélium carotidienne

Découvrez le séquençage d'ARN à noyau unique par gouttelettes pour caractériser les neurones cardiaques sympathiques de souris. Cette méthode permet le multiplexage par anticorps à code-barres et l'analyse de l'architecture neuronale.

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

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