Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal
3 décembre 2021
Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.
Bien que relativement simple, la technique d’imprégnation de Golgi comporte des étapes délicates et le fait de ne pas les faire correctement entraîne des cellules impropres à l’analyse. Cette technique permet un marquage rapide et reproductible des neurones imprégnés de Golgi. Et de plus, la petite erreur-type de la moyenne permet de comparer les expériences.
La partie la plus difficile de cette technique est de couper les sections de cryostat, car il y a une consistance et une fixation inhabituelles, et donc les obtenir sur la glissière à plat est un peu un défi. Tout d’abord, placez une petite quantité de milieu tissulaire sur un mandrin de cryostat pré-refroidi. Montez les blocs cérébraux sur des mandrins de cryostat en décongelant légèrement un côté du bloc dans une main gantée et en le plaçant sur le milieu tissulaire.
Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Utilisez la plaque anti-roulis ou la brosse pour garder la section à plat pendant la coupe. Coupez des sections de 100 micromètres sur un cryostat à moins 22 degrés Celsius.
Montez le dégel, si possible, en utilisant une glissière à température ambiante et opposez-la rapidement à la section. Alternativement, gardez les lames dans le cryostat, afin qu’elles gèlent. Transférez la section avec une pince froide ou un pinceau froid, puis décongelez le support.
Montez trois à quatre sections coronales sur les affaissements. Nettoyez le couteau avec des lingettes en papier entre les tranches. Si le couteau nécessite un nettoyage supplémentaire, utilisez 100% d’éthanol et séchez-le avant de couper la tranche suivante.
Placez les diapositives dans des racks, suffisamment espacés pour permettre à la solution d’accéder aux sections. Placer les sections dans de l’eau distillée deux fois pendant quatre minutes avant de les placer dans la solution d’imprégnation de Golgi pendant 10 minutes. Séparez les bordereaux de couverture pour vous assurer qu’un seul bordereau de couverture est placé sur les sections.
Couvrez les glissières de verre avec une quantité généreuse de support de montage avant de placer un couvercle en verre sur la glissière. Une fois la couverture glissée, les lames sèches ont été signalées sur tout papier non poreux pendant trois à cinq jours, en les déplaçant légèrement, surtout après le premier jour pour éviter de coller. Transférez ensuite les diapositives dans des porte-diapositives et, idéalement, séchez les diapositives pendant au moins trois semaines avant de les examiner.
Pour analyser la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les neurones pyramidaux du cortex préfrontal médian et de la région CA1 de l’hippocampe, mesurez la longueur dendritique à l’aide d’un programme d’analyse d’images. Comptez les épines sur les dendrites à l’aide d’un compteur à main et enregistrez la longueur et le nombre d’épines. Pour l’analyse, choisissez des neurones avec des corps cellulaires et des dendrites lorsqu’ils sont imprégnés, et des dendrites qui sont continues et distinguables des cellules adjacentes.
La figure montre des exemples de cellules imprégnées de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe est montré à faible et haute puissance. La figure illustre une expérience dans laquelle la densité basale de la colonne vertébrale dendritique a été augmentée sur des cellules pyramidales chez des rats adolescents mâles et femelles après enrichissement environnemental en CA1 et dans le cortex préfrontal médian. Il est difficile de garder les sections suffisamment froides lors de la coupe et nous utilisons beaucoup de spray de congélation pour ce faire.
Et puis par la suite, il est difficile de mettre les sections sur les diapositives et de les faire sécher à plat. Cette technique est utilisée pour examiner les caractéristiques neuroanatomiques. Il peut être utilisé seul ou en combinaison avec d’autres méthodes de traçage neuroanatomique.
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Aperçu
Cette étude décrit une méthode Golgi rapide modifiée pour la coloration spécifique des neurones dans l'hippocampe et le cortex préfrontal médian de rats. La technique permet une marquage efficace des neurones, autorisant l'analyse des caractéristiques neuroanatomiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neuroanatomie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La technique d'imprégnation de Golgi est une méthode bien établie pour la coloration des neurones.
- L'application permet l'étude de la structure dendritique et de la densité des épines.
- La méthode peut être adaptée à diverses régions du système nerveux.
- Des difficultés existent lors de la coupe de sections sur cryostat en raison de la consistance du tissu.
Objectif de l'étude
- Améliorer la méthode de Golgi existante afin d'obtenir un meilleur marquage neuronal.
- Étudier la densité des épines dendritiques dans des régions cérébrales spécifiques.
- Explorer les effets de facteurs environnementaux sur la morphologie neuronale.
Méthodes utilisées
- Technique d'imprégnation rapide de Golgi sur des tissus cérébraux de rat.
- Grande précision lors de la coupe de sections de 100 micromètres au cryostat.
- Techniques de décongélation pour le montage correct des sections sur des lames.
- Incubation dans la solution de Golgi pour une coloration neuronale efficace.
- L'analyse consistait à mesurer la longueur dendritique et à compter les épines à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.
Résultats principaux
- La technique a permis un marquage reproductible des neurones, adapté à l'analyse.
- Des preuves ont montré une densité accrue des épines dans les neurones pyramidaux suite à un enrichissement environnemental.
- Une identification réussie des modifications de la densité des épines dendritiques basales chez des rats adolescents mâles et femelles a été notée.
Conclusions
- La présente étude valide la méthode de Golgi modifiée comme une approche fiable pour l'analyse neuroanatomique.
- Les connaissances sur la densité des épines dendritiques contribuent à la compréhension de la plasticité neuronale.
- Des applications futures pourraient inclure l'évaluation des influences environnementales sur la morphologie cérébrale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode de coloration rapide Golgi fournit une approche reproductible et à faible variabilité pour visualiser la densité des épines dendritiques dans des régions cérébrales clés pertinentes pour les modèles de maladies neuropsychiatriques. En permettant une quantification cohérente des structures synaptiques dans l'hippocampe et le cortex préfrontal, cette technique soutient la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes de découverte de médicaments du système nerveux central. Sa compatibilité avec le stockage des tissus congelés et sa faible variabilité inter-expérimentale améliorent la fiabilité du test pour les études précliniques longitudinales.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques liées à la plasticité synaptique et à la morphologie dendritique dans des circuits neuronaux pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures normalisées et quantitatives de la densité des épines par dendrite de 10 µm, permettant des comparaisons fiables entre expériences.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques biologiques en reliant l'architecture neuroanatomique structurelle aux résultats fonctionnels dans des modèles d'enrichissement environnemental et pharmacologiques.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Produit des neurones uniformément imprégnés avec un fond de débris minime, permettant une visualisation et un comptage fiables des épines dendritiques.
- Reproductibilité : Présente des écarts extrêmement faibles de la densité des épines entre les expériences, assurant une grande précision du test et une puissance statistique élevée.
- Extensibilité : Permet l’accumulation de tissus cérébraux et leur stockage à congélation jusqu’au traitement, facilitant le traitement par lots et l’efficacité du flux de travail dans les pipelines de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Applicable aux régions de l'hippocampe et du cortex préfrontal impliquées dans les modèles de cognition, de dépression et de schizophrénie.
- Continuité translationnelle : Permet l'analyse de la densité des épines comme paramètre de lecture aligné sur des biomarqueurs pour évaluer les effets des composés sur la structure neuronale.
- Réduction des risques mécanistiques : Relie les modifications structurelles (par exemple, l'augmentation de la densité des épines après enrichissement) à la plasticité fonctionnelle, renforçant ainsi la confiance dans les cibles des programmes du SNC.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'au criblage phénotypique préclinique, en particulier pour les programmes centrés sur le système nerveux central évaluant la neuroplasticité et l'intégrité synaptique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur la structure dendritique et la densité des épines en tant qu'indicateurs de la santé synaptique et de la connectivité neuronale.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles (nombre d'épines par 10 µm de dendrite) adaptés à une analyse à haut contenu et à la comparaison des effets de composés.
- Analytique : Permet la comparaison statistique de la densité des épines entre différentes conditions à l’aide de l’analyse d’image et du comptage manuel, une faible erreur type de la moyenne renforçant la fiabilité des données.
- Recherche translationnelle : S’inscrit dans la validation préclinique en fournissant des indicateurs structuraux corrélés à des résultats fonctionnels dans les modèles d’apprentissage et de mémoire.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une plateforme neuroanatomique standardisée et réutilisable, applicable à plusieurs régions cérébrales et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des évaluations de la plasticité synaptique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à une imprégnation constante, à un fond faible et à une variance minimale entre les expériences.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant des données neuroanatomiques fiables permettant de prioriser les composés ayant des effets démontrables sur la structure dendritique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque en quantifiant des biomarqueurs structurels du SNC associés à des paramètres cognitifs et comportementaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microtomie au cryostat et en manipulation des tissus afin de maintenir l'aplomb et l'intégrité des sections lors de la coupe à -22 °C.
- Dépend de techniques adéquates de montage par décongélation et de l'utilisation d'une lame anti-rouleau ou d'un pinceau pour éviter les dommages aux sections pendant le transfert sur les lames.
- Exige un temps de coloration standardisé (10 minutes dans la solution de Golgi) et une application soigneuse du milieu de montage pour garantir une marquage neuronal constant.
- Implique des périodes de séchage prolongées (3 à 5 jours initialement, puis ≥3 semaines) avant l'acquisition d'images, nécessitant une planification rigoureuse du déroulement du travail.
- Repose sur le travail de personnel qualifié pour le comptage précis des épines dendritiques et la mesure de leur longueur, à l’aide d’outils d’analyse d’image et de compteurs manuels.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
