Name: Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Apprenez la coloration rapide de Golgi pour visualiser les dendrites dans l'hippocampe et le cortex préfrontal du rat. Cette technique permet d'analyser la densité des épines dendritiques et la plasticité neuronale.

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Ce travail a été soutenu par Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Toutes les procédures expérimentales sont approuvées par le Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee et sont conformes au NIH Guide for the Care and Use of Animals.
1. Isolement et infiltration du tissu cérébral
<ol><li>Prémélanger les solutions A et B du kit de coloration Golgi 24 h avant utilisation et conserver dans des bouteilles sombres et/ou dans l’obscurité. Faire environ 80 mL de solution A et B mélange qui est suffisant pour changer la solution après 24 h. Conserver dans des bouteilles hermétiques. REMARQUE: La perfusion avec une solution saline ou du paraformaldéhyde n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Sacrifiez les rats par guillotine après l’euthanasie au dioxyde de carbone et enlevez les cerveaux en quelques secondes. Rincer les cerveaux dans une solution saline si nécessaire, mais n’est pas nécessaire.<ol>
<li>Placez le cerveau, le cortex vers le bas pour que l’hypothalamus soit visible car les coupures sont faites antérieurement et postérieurement à celui-ci, sur une surface non poreuse. Coupé dans un bloc antérieur (contient le cortex préfrontal) et postérieur (contient l’hippocampe) comme le montre la figure 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez les blocs dans les solutions prémélangées de A et B, en vous assurant qu’ils sont bien immergés dans la solution. Assurez-vous que le volume des solutions A et B est suffisant pour immerger les blocs. Conservez les blocs dans des bouteilles brunes ou des bouteilles transparentes recouvertes de papier d’aluminium (pour empêcher la lumière d’entrer) dans l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Remplacer la solution après 24 h et conserver dans l’obscurité pendant encore 13 jours à température ambiante. REMARQUE: S’il est utilisé avec des cerveaux de souris, il n’est pas nécessaire de bloquer et le cerveau entier peut être placé dans la solution. Si vous colorez des zones du cerveau de taille différente, le temps passé dans les solutions A et B peut devoir être déterminé par essais et erreurs.</li>
	<li>Après deux semaines, le tissu est bien infiltré avec les solutions A et B, transférer les blocs dans la solution cryoprotectrice (solution C dans le kit de coloration golgi) et les laisser pendant 48-72 h à 4 °C. REMARQUE: Après cryoprotection, les blocs peuvent être congelés jusqu’à un traitement ultérieur. Notez également que toutes les solutions du kit sont collectées et éliminées en tant que déchets dangereux.</li>
	<li>Gelez le cerveau, le cortex vers le bas, sur une lame de verre sur de la glace sèche. Une fois congelé, coupez sur le cryostat ou conservez à -80 °C jusqu’à sectionnement à l’aide d’un cryostat. REMARQUE: Ne pas congeler dans l’azote liquide car cela produit des fissures dans les tissus.</li>
</ol>2. Sectionnement des tissus cérébraux
<ol><li>Placez une petite quantité de milieu tissulaire sur un mandrin de cryostat pré-refroidi. Montez des blocs sur des mandrins de cryostat en décongelant un côté du bloc légèrement à la main (ganté) et en le plaçant sur le milieu tissulaire. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’intégrer le tissu. Le bloc contenant l’hippocampe est un peu plus facile à couper que le bloc avec le cortex préfrontal car ce dernier est antérieur au corps calleux et les deux moitiés sont séparées.</li>
	<li>Couper des sections de 100 μm sur un cryostat à -22 °C et les monter sur des lames de sous-lit. Des sections jusqu’à 150 μm d’épaisseur peuvent être utilisées. Essayez de monter 3-4 sections coronales par diapositive, car cela réduit le nombre de diapositives à traiter. Utilisez l’une des techniques suivantes pour garder les sections gelées jusqu’à ce qu’elles arrivent sur la diapositive. REMARQUE: Ces sections ne sont pas fixées de la manière habituelle et ont donc tendance à fondre rapidement. Laissez les sections fondre sur la diapositive. S’ils commencent à fondre avant d’être placés sur la glissière, il est impossible de les faire tomber à plat sur la glissière. Il existe plusieurs techniques pour ce faire.<ol>
<li>Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Selon la température et l’humidité dans la pièce, cela peut être nécessaire pour chaque section. Utilisez la plaque antiroulis ou une brosse pour garder la section à plat pendant la coupe. REMARQUE: Assurez-vous d’avoir suffisamment de spray de congélation. Plusieurs boîtes peuvent être utilisées lors de la coupe de 20 blocs.</li>
		<li>Montez le dégel, si possible, à l’aide d’une glissière à température ambiante et l’apposez-la rapidement dans la section. Avec de la pratique, on peut monter plusieurs sections à la fois. Si cela ne fonctionne pas, gardez les glissières dans le cryostat pour qu’elles soient très froides et transférez la section avec une pince froide ou un pinceau froid, puis décongelez le support.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nettoyez le couteau avec des lingettes en papier entre les tranches. Si le couteau nécessite plus de nettoyage, utilisez 100% d’éthanol (EtOH) et laissez-le sécher avant de couper la tranche suivante.</li>
	<li>Une fois montée sur la glissière, placez la glissière à plat sur des plateaux en carton et laissez sécher les sections à température ambiante (pendant plusieurs heures jusqu’à un maximum de 48 h) dans l’obscurité. Ne couvrez pas le plateau de diapositives. Assurez-vous que les sections sont complètement sèches avant l’imprégnation golgi. Conserver à plat, dans l’obscurité, sur des plateaux coulissants jusqu’à l’imprégnation de Golgi. REMARQUE: Le séchage des sections ne cause aucun dommage.</li>
</ol>3. Coloration et déshydratation du tissu cérébral
<ol><li>Effectuer la coloration dans les plats de teinture de verre. Mélanger les solutions D et E immédiatement avant la coloration. Conformément au protocole, ajouter une partie de la solution D, une partie de la solution E et deux parties d’eau distillée. Pour les plats de teinture en verre, faites une solution de 200 mL pour immerger complètement les sections. Pour les pots Koplin, cela nécessite moins de volume.</li>
	<li>Placez les diapositives dans des racks suffisamment espacés pour permettre à la solution d’accéder aux sections.</li>
	<li>Placer les sections dans de l’eau distillée pendant 4 min (2x) avant de les placer dans la solution de coloration par imprégnation Golgi pendant 10 min. Changez la solution de coloration toutes les 70 sections. Changez l’eau distillée lorsqu’elle jaunit. REMARQUE: Le moment de l’étape de coloration est critique. Trop court ne permet pas assez de coloration et trop long provoque une coloration excessive, ce qui rend les dendrites difficiles à séparer lors de l’analyse. Une fois sorti de la solution de coloration, le moment est moins critique.</li>
	<li>Déshydratez les sections comme suit: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agent de compensation (5 min; 3x). Changez souvent toutes les solutions, en particulier l’EtOH 100% et l’agent de compensation pour vous assurer que les sections restent anhydres. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de passer par une étape EtOH de 50%. La contre-coloration n’est pas nécessaire pour la visualisation cellulaire car l’imprégnation de Golgi offre un contraste suffisant. L’utilisation d’autres agents de compensation n’a pas fonctionné aussi bien que celle utilisée ici (voir tableau des matières).</li>
	<li>Couvercle avec des couvercles en verre de 60 mm de long avec une quantité généreuse de support de montage. Assurez-vous qu’il y a le moins de bulles d’air possible. Si nécessaire, retirez soigneusement et refaites le couvercle (peut être fait même des semaines plus tard). Faites-le très lentement afin de ne pas endommager la section (peut être fait en raison de la grande quantité de support de montage). REMARQUE: Une grande quantité de support de montage est quelque peu salissante mais toujours nécessaire car suffisamment de support de montage doit être utilisé pour couvrir les sections épaisses de 100 μm.</li>
	<li>Pour vous assurer qu’un seul couvercle est placé sur les sections, séparez les couvercles avant le processus.</li>
	<li>Une fois la couverture glissée, les lames sèches à plat sur tout papier non poreux pendant 3 à 5 jours, en les déplaçant légèrement, surtout après le premier jour, pour éviter de coller. Après 3-5 jours, transférez les diapositives sur des supports de diapositives et, idéalement, des lames sèches pendant au moins 3 semaines avant de les examiner. Gardez les glissières à plat pour réduire la possibilité de formation de bulles d’air.</li>
</ol>4. Détermination de la densité de la colonne vertébrale dendritique
<ol><li>Pour l’analyse de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les neurones pyramidaux de la région mPFC et CA1 de l’hippocampe, examiner les dendrites basales secondaires les plus latérales et les dendrites apicales tertiaires les plus latérales, comme décrit à l’étape 4.1.1 (Figure 2).<ol>
<li>Choisissez une dendrite, mesurez la longueur de la dendrite à l’aide d’un programme d’analyse d’image, comptez les épines sur les dendrites à l’aide d’un compteur manuel et enregistrez la longueur et le nombre d’épines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étudiez et analysez six cellules par région (mPFC, CA1) par cerveau. Quantifiez un minimum de six cerveaux par groupe comme décrit précédemment 7,8. Choisissez des neurones qui répondent aux critères d’analyse suivants : les corps cellulaires et les dendrites sont bien imprégnés ; les dendrites se distinguent des cellules adjacentes et sont continues.</li>
	<li>Comptez les épines à 1000x (immersion dans l’huile) en comptant à la main avec un microscope optique et mesurez la longueur dendritique à l’aide d’un programme d’analyse d’images. Calculer la densité de la colonne vertébrale en divisant le nombre de la colonne vertébrale par la longueur de la dendrite et exprimer les données comme le nombre d’épines / 10 μm de dendrite. REMARQUE: Il existe des méthodes beaucoup plus sophistiquées pour différencier les sous-types de colonne vertébrale et l’architecture dendritique qui peuvent être utilisées, mais le comptage manuel avec un microscope optique à 1000x peut donner un résultat rapide qui peut ensuite déterminer si une enquête plus approfondie est nécessaire. Bien que tous les efforts soient faits pour échantillonner systématiquement des dendrites similaires, il existe des variations d’épaisseur qui peuvent affecter le comptage.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
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<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le présent protocole décrit une méthode d’imprégnation de Golgi qui permet un traitement simultané rapide de nombreuses sections. Il s’agit d’une amélioration par rapport aux5 méthodes plus intensives en main-d’œuvre décrites précédemment et donne systématiquement des neurones imprégnés pour l’analyse. En outre, il y a moins d’exposition aux produits chimiques toxiques utilisés dans l’imprégnation de Golgi. La partie la plus difficile du processus consiste à faire en sorte que les sections soient ...

La méthode d’utilisation du dichromate de potassium et du nitrate d’argent pour marquer les neurones a été décrite pour la première fois par Camillo Golgi 1,2 et ensuite utilisée par Santiago Ramon y Cajal pour produire un immense corpus de travaux différenciant les sous-types neuronaux et gliaux. Un livre récemment publié avec ses illustrations est maintenant disponible3. Suite aux études de Ramon y Cajal, qui ont été publiées il y a plus de 100 ans, très peu d’imprégnation Golgi a été utilisée. L’imprégnation de Golgi est un processus laborieux qui permet la visualisation tridimensionnelle des neurones avec un microscope optique. Il y a eu de nombreuses modifications de la méthode Golgi au fil des ans pour rendre la méthode plus facile et la coloration plus cohérente4. En 1984, Gabbott et Somogyi5 ont décrit la procédure d’imprégnation golgi à section unique qui a permis un traitement plus rapide. Cette méthode d’imprégnation de Golgi nécessite une perfusion avec 4% de paraformaldéhyde et 1,5% d’acide picrique, post-fixation suivie d’une coupe vibratome dans un bain de dichromate de potassium à 3%. Les sections sont montées sur des lames de verre, les quatre coins des couvercles collés de sorte que lorsqu’ils sont immergés dans du nitrate d’argent, la diffusion est progressive. Les couvercles sont ensuite enlevés, les sections sont déshydratées et finissent par glisser définitivement avec un support de montage. Cette technique a été utilisée avec succès pour marquer les neurones et la glie 6,7,8 dans l’hippocampe. La méthode rapide de Golgi décrite ici est une amélioration car il y a beaucoup moins d’exposition au dichromate de potassium et au nitrate d’argent et aucun paraformaldéhyde et acide picrique ne sont utilisés. De plus, bien que les cellules imprégnées à l’aide de modifications de la méthode Gabbott et Somogyi5 puissent être analysées, les sections étaient souvent surexposées ou sous-exposées ou tombaient des lames pendant l’étape de déshydratation et généralement, plusieurs expériences devaient être regroupées pour avoir suffisamment de cellules pour l’analyse.
Le présent protocole décrit l’utilisation du kit de coloration golgi (voir Tableau des matériaux) pour étiqueter les dendrites et les épines dendritiques dans l’hippocampe et le cortex préfrontal médian (mPFC) du rat. Les avantages de cette méthode par rapport aux précédentes sont qu’elle est rapide, qu’il y a moins d’exposition aux produits chimiques nocifs pour le chercheur et qu’il y a une coloration constante des neurones. Le protocole décrit ci-dessous a été utilisé avec des modifications mineures pour évaluer la densité de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le mPFC du rat dans de nombreuses études 9,10,11,12,13,14,15.

<table><tbody><tr><td>Plateaux de lames en carton</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles 24 x 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiKit de teintures</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>Stable à RT dans l’obscurité pendant des mois ; Kit de coloration Golgi</td></tr><tr><td>Freezing Spray</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>agent nettoyant</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>Kaysville, UT, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>support de montage</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Utilisé pour monter des cerveaux sur mandrin de cryostat</td></tr></tbody></table>

coloration rapide de golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

L’imprégnation golgi, utilisant le kit de coloration Golgi avec des adaptations mineures, est utilisée pour imprégner les épines dendritiques dans l’hippocampe du rat et le cortex préfrontal médian. Cette technique est une amélioration marquée par rapport aux méthodes précédentes d’imprégnation de Golgi car les produits chimiques prémélangés sont plus sûrs à utiliser, les neurones sont toujours bien imprégnés, il y a beaucoup moins de débris de fond et, pour une région donnée, il existe des écarts extrêmement faibles dans la densité de la colonne vertébrale entre les expériences. De plus, les cerveaux peuvent être accumulés après un certain point et conservés congelés jusqu’à un traitement ultérieur. En utilisant cette méthode, toute région du cerveau d’intérêt peut être étudiée. Une fois tachée et recouverte glissée, la densité de la colonne vertébrale dendritique est déterminée en comptant le nombre d’épines pour une longueur de dendrite et exprimée en densité de colonne vertébrale par dendrite de 10 μm.

En utilisant la méthode rapide de Golgi, les cellules sont toujours bien imprégnées de sorte qu’il y a beaucoup de cellules à analyser. Il s’agit d’une nette amélioration par rapport aux méthodes précédentes où les expériences devaient être regroupées pour disposer de suffisamment de données pour l’analyse. Par conséquent, plus d’échantillons peuvent être traités à la fois et les cerveaux peuvent être conservés congelés jusqu’au traitement. Des exemples de cellules imprégnées de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe s...

Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.

Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Bien que relativement simple, la technique d’imprégnation de Golgi comporte des étapes délicates et le fait de ne pas les faire correctement entraîne des cellules impropres à l’analyse. Cette technique permet un marquage rapide et reproductible des neurones imprégnés de Golgi. Et de plus, la petite erreur-type de la moyenne permet de comparer les expériences.La partie la plus difficile de cette technique est de couper les sections de cryostat, car il y a une consistance et une fixation inhabituelles, et donc les obtenir sur la glissière à plat est un peu un défi. Tout d’abord, placez une petite quantité de milieu tissulaire sur un mandrin de cryostat pré-refroidi. Montez les blocs cérébraux sur des mandrins de cryostat en décongelant légèrement un côté du bloc dans une main gantée et en le plaçant sur le milieu tissulaire.Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Utilisez la plaque anti-roulis ou la brosse pour garder la section à plat pendant la coupe. Coupez des sections de 100 micromètres sur un cryostat à moins 22 degrés Celsius.Montez le dégel, si possible, en utilisant une glissière à température ambiante et opposez-la rapidement à la section. Alternativement, gardez les lames dans le cryostat, afin qu’elles gèlent. Transférez la section avec une pince froide ou un pinceau froid, puis décongelez le support.Montez trois à quatre sections coronales sur les affaissements. Nettoyez le couteau avec des lingettes en papier entre les tranches. Si le couteau nécessite un nettoyage supplémentaire, utilisez 100% d’éthanol et séchez-le avant de couper la tranche suivante.Placez les diapositives dans des racks, suffisamment espacés pour permettre à la solution d’accéder aux sections. Placer les sections dans de l’eau distillée deux fois pendant quatre minutes avant de les placer dans la solution d’imprégnation de Golgi pendant 10 minutes. Séparez les bordereaux de couverture pour vous assurer qu’un seul bordereau de couverture est placé sur les sections.Couvrez les glissières de verre avec une quantité généreuse de support de montage avant de placer un couvercle en verre sur la glissière. Une fois la couverture glissée, les lames sèches ont été signalées sur tout papier non poreux pendant trois à cinq jours, en les déplaçant légèrement, surtout après le premier jour pour éviter de coller. Transférez ensuite les diapositives dans des porte-diapositives et, idéalement, séchez les diapositives pendant au moins trois semaines avant de les examiner.Pour analyser la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les neurones pyramidaux du cortex préfrontal médian et de la région CA1 de l’hippocampe, mesurez la longueur dendritique à l’aide d’un programme d’analyse d’images. Comptez les épines sur les dendrites à l’aide d’un compteur à main et enregistrez la longueur et le nombre d’épines. Pour l’analyse, choisissez des neurones avec des corps cellulaires et des dendrites lorsqu’ils sont imprégnés, et des dendrites qui sont continues et distinguables des cellules adjacentes.La figure montre des exemples de cellules imprégnées de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe est montré à faible et haute puissance. La figure illustre une expérience dans laquelle la densité basale de la colonne vertébrale dendritique a été augmentée sur des cellules pyramidales chez des rats adolescents mâles et femelles après enrichissement environnemental en CA1 et dans le cortex préfrontal médian. Il est difficile de garder les sections suffisamment froides lors de la coupe et nous utilisons beaucoup de spray de congélation pour ce faire.Et puis par la suite, il est difficile de mettre les sections sur les diapositives et de les faire sécher à plat. Cette technique est utilisée pour examiner les caractéristiques neuroanatomiques. Il peut être utilisé seul ou en combinaison avec d’autres méthodes de traçage neuroanatomique.

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