Retrait d’un site de démarrage translationnel interne de l’ARNm tout en conservant l’expression de la protéine pleine longueur
16 mars 2022
Le protocole actuel décrit une seule mutation M213L dans Gja1 qui conserve la génération Connexin43 pleine longueur mais empêche la traduction de l’isoforme GJA1-20k traduite en interne plus petite.
La difficulté avec une substitution de résidu unique est de génotyper efficacement les animaux malgré la différence entre les résidus uniques. L’utilisation spéciale d’une enzyme de restriction n’ajoute qu’une seule étape rapide et peu coûteuse au génotypage typique basé sur la PCR. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quel autre modèle murin avec un point de mutation si la séquence cible est reconnue par une enzyme de restriction, ce qui est généralement le cas.
Coupez un à trois millimètres de l’extrémité de la queue avec des ciseaux propres et transférez-le dans un tube PCR à huit bandes de 0,2 millilitre. Après avoir contenu l’échantillon de queue tel que décrit dans le manuscrit, conservez-le à T-moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’extraction, jusqu’à environ une semaine. Ajouter 100 microlitres de solution de lyse tissulaire par tube et bien mélanger, puis faire tourner à l’aide d’une minicentrifugeuse de table à 2 200 fois G pendant 10 secondes à température ambiante.
Assurez-vous que les échantillons de queue sont immergés dans la solution. Réglez les tubes sur un cycleur thermique en programmant les paramètres de lyse tissulaire, d’inactivation et de maintien. Conservez le lysat tissulaire à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine si la PCR ne peut pas être effectuée immédiatement.
Préparer une solution pcR contenant cinq microlitres d’eau sans nucléase, 0,75 microlitres d’amorces avant et arrière de 10 micromolaires et 7,5 microlitres de mélange maître PCR par échantillon dans un nouveau tube PCR. Ajouter un microlitre du lysat tissulaire préalablement préparé à la solution PCR. Mélangez bien la solution PCR et faites tourner vers le bas avec une minicentrifugeuse de table à 2 200 fois G pendant 10 secondes à température ambiante.
Placez les tubes sur un cycleur thermique programmé. Une fois la réaction terminée, conservez les produits pcR à quatre degrés Celsius pendant un à deux mois ou environ un an à moins 20 degrés Celsius. Préparer la solution enzymatique contenant sept microlitres d’eau sans nucléase, deux microlitres de tampon CutSmart à une force de 10X et un microlitre d’enzyme de restriction NlaIII.
S’il y a plusieurs échantillons, multipliez chaque contenu pour faire le mélange et aliquote 10 microlitres par tube. Ajouter 10 microlitres de produit PCR préalablement obtenu à la solution enzymatique par tube. Mélangez bien et tournez avec la minicentrifugeuse de table comme démontré précédemment.
Placez les tubes sur un cycleur thermique programmé ou un bloc thermique. Conservez le produit après l’incubation dans des conditions froides. Ajouter 0,75 gramme d’agarose dans 50 millilitres de tampon TAE à force unique.
Mélanger et chauffer l’agarose au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle se dissout complètement. Après l’avoir refroidi, ajoutez cinq microlitres de tache d’ADN et mélangez doucement. Versez 25 millilitres de gel d’agarose dans le moule en gel et laissez le gel se solidifier.
Chargez 10 microlitres de produit PCR digéré dans le puits. Faites fonctionner le gel avec 100 volts pendant 35 minutes. Imagez le gel d’agarose sous lumière ultraviolette.
L’électrophorèse de l’agarose réalisée à l’aide du produit PCR digéré a donné plusieurs bandes de tailles différentes dans chaque génotype, avec deux bandes de type sauvage, trois chez les hétérozygotes et une chez les homozygotes, respectivement. L’injection test avec analyse de blastocyste a donné un taux de réussite de 76,9% sur l’injection de 50 nanogrammes par microlitre des oligos donneurs, et un taux de réussite de 25% sur l’injection de 25 nanogrammes par microlitre des mêmes oligos donneurs, respectivement. Enfin, l’injection de 50 nanogrammes par microlitre des oligos donneurs avec une précipitation d’éthanol a permis d’obtenir des animaux fondateurs avec un taux de réussite de 50%.
La purification des oligo-donneurs par précipitation d’éthanol a réduit la toxicité tout en conservant une efficacité élevée d’édition du génome. Une manipulation prudente et l’ajout d’une faible quantité de réactifs sont très importants. Assurez-vous qu’ils sont correctement ajoutés et qu’ils sont bien mélangés.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de génotypage d'animaux portant une mutation unique M213L dans le gène Gja1, entraînant la production de la Connexine43 complète tout en empêchant la traduction de l'isoforme plus petite GJA1-20k. La méthode met l'accent sur l'efficacité et le faible coût de l'utilisation d'enzymes de restriction en combinaison avec un génotypage basé sur la PCR.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Génétique
- Biologie moléculaire
- Modèles animaux
Contexte
- Importance de l'identification des mutations génétiques
- Difficultés liées aux substitutions d'un seul résidu
- Utilisation des enzymes de restriction en génotypage
Méthodes utilisées
- Typage génétique par PCR
- Modèles murins porteurs de mutations ponctuelles
- Électrophorèse sur gel d'agarose pour l'analyse de l'ADN
Résultats principaux
- Identification réussie de génotypes présentant des profils de bandes distincts
- Taux de réussite élevés dans la génération d'animaux fondateurs
- Efficacité validée des méthodes décrites pour l'analyse génétique
Conclusions
- L'étude démontre un protocole efficace pour le génotypage des mutations dans les modèles murins.
- Elle apporte des méthodologies précieuses pour la recherche génétique en biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet une génotypage précis des mutations ponctuelles dans les modèles murins, soutenant les études de validation ciblée dans lesquelles l'expression protéique isoforme-spécifique doit être analysée. En éliminant les isoformes tronquées interférentes tout en préservant la fonction de la protéine pleine longueur, il améliore la détection mécanistique lors de la phase initiale de découverte. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des hypothèses thérapeutiques impliquant la biologie de la Connexine 43 et les voies connexes des jonctions gap.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en isolant la contribution fonctionnelle de la forme complète de Cx43 par rapport aux isoformes tronquées au niveau de l'extrémité N-terminale.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode de génotypage évolutive permettant de distinguer les allèles sauvages, hétérozygotes et mutants homozygotes dans de grandes cohortes.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en clarifiant si les phénotypes observés résultent d'une perte de la protéine complète ou de mécanismes spécifiques à certaines isoformes.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Génère des échantillons d'ADN avec des profils de fragments de restriction adaptés aux protocoles de criblage à haut débit.
- Production quantitative : Permet la quantification allèle-spécifique par analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction après PCR.
- Reproductibilité : Standardise la génotypage entre laboratoires grâce à l'ajout peu coûteux d'une seule enzyme aux protocoles PCR existants.
Recherche Translationnelle et Préclinique
- Pertinence pour les maladies : Facilite les modèles précliniques dans lesquels le trafic de la Cx43 et l'assemblage des jonctions communicantes sont impliqués dans des affections cardiaques, neurologiques ou oncologiques.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre le génotype moléculaire et le phénotype en préservant l'expression de la Cx43 pleine longueur tout en réduisant celle de GJA1-20k.
- Décisions adaptées au risque : Permet d'établir des critères de poursuite ou d'arrêt en corrélant les niveaux d'expression des isoformes avec des paramètres fonctionnels in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation précoce de la cible aux tests d'efficacité préclinique, notamment lorsque les fonctions protéiques spécifiques aux isoformes doivent être précisées.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant des modèles génétiques capables de distinguer l'activité de la protéine pleine longueur de celle d'isoformes tronquées.
- Tri : Fournit de l'ADN génomique prêt à l'emploi pour des applications en aval telles que la validation de CRISPR ou la gestion de colonies d'élevage.
- Analyse : Produit des profils de bandes nets et facilement interprétables sur gel d'agarose, permettant une attribution rapide du génotype sans séquençage.
- Recherche translationnelle : Permet des études précliniques dans lesquelles la localisation membranaire de Cx43 et la communication intercellulaire constituent des paramètres mécanistiques essentiels.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à toute mutation ponctuelle où un site de restriction peut être introduit ou supprimé, offrant ainsi une plateforme de génotypage réutilisable.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles en isolant les contributions spécifiques aux isoformes.
- Valeur opérationnelle : Augmente le débit et réduit le coût par échantillon grâce à une étape unique de digestion par enzymes de restriction après PCR.
- Valeur stratégique : Améliore la confiance dans les décisions lors de l'optimisation des candidats en clarifiant les relations génotype-phénotype.
- Impact sur le portefeuille : Permet la progression ajustée au risque de candidats ciblant des voies dépendantes de Cx43.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie moléculaire en matière de conception des amorces de PCR et de sélection des enzymes de restriction.
- Suppose l'accès à des thermocycleurs, des systèmes d'électrophorèse sur gel d'agarose et du matériel d'imagerie UV.
- Exige une standardisation des conditions de lyse des tissus et de PCR entre les utilisateurs pour des résultats reproductibles.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles dépend du contexte de séquence et de la compatibilité avec les enzymes de restriction.
- Limitée aux mutations qui modifient ou créent un site de reconnaissance pour une enzyme de restriction ; les mutations silencieuses peuvent nécessiter des stratégies alternatives.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
