Name: Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez une méthode de cautérisation thermique du plexus vasculaire limbique pour induire un glaucome expérimental chez le rat. Ce modèle reproductible permet d'étudier la neurodégénérescence rétinienne et les mécanismes physiopathologiques oculaires in vivo.

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Nous remercions nos techniciens de laboratoire José ; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza et Luciano Cavalcante Ferreira. Cette recherche a été financée par la FAPERJ, le CNPq et le CAPES.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La cautérisation du plexus limbique (LPC) est un nouveau modèle post-trabéculaire qui présente l’avantage de cibler des structures vasculaires facilement accessibles ne nécessitant pas de dissection conjonctivale ou à tenon17,28. Contrairement au modèle de cautérisation des veines vortex, un modèle d’OHT renommé basé sur l’atteinte chirurgicale du drainage veineux choroïde, la congestion veineuse ne devrait pas influencer l’augmentation de la PIO dans le modèle L...

La littérature médicale considère le glaucome comme un groupe hétérogène de neuropathies optiques caractérisées par une dégénérescence progressive des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), des dendrites, du soma et des axones, entraînant une ventouse structurelle (excavation) du disque optique et une détérioration fonctionnelle du nerf optique, conduisant à l’amaurose dans les cas non contrôlés en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau1. Le glaucome est actuellement la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde, et devrait toucher environ 111,8 millions de personnes en 20402, affectant ainsi profondément la qualité de vie des patients et entraînant d’importantes préoccupations socio-économiques3.
L’élévation de la pression intraoculaire (PIO) est l’un des facteurs de risque les plus importants et les seuls modifiables pour le développement et la progression du glaucome. Parmi les multiples types de glaucome, tous, à l’exception du glaucome à tension normale (NTG), sont associés à une PIO élevée à un moment donné de l’histoire clinique de la maladie. Malgré des avancées cliniques et chirurgicales remarquables pour cibler la PIO et ralentir ou arrêter la progression de la maladie, les patients perdent toujours la vue en raison du glaucome 4,5. Par conséquent, une compréhension approfondie de la physiopathologie complexe et multifactorielle de cette maladie est impérative pour le développement de traitements plus efficaces, en particulier pour fournir une neuroprotection aux CGR.
Parmi une variété d’approches expérimentales pour la compréhension des mécanismes de la maladie, les modèles animaux basés sur l’hypertension oculaire (OHT) ressemblent le plus au glaucome humain. Les modèles de rongeurs sont particulièrement utiles car ils sont peu coûteux, faciles à manipuler, peuvent être manipulés génétiquement, ont une courte durée de vie et présentent des caractéristiques anatomiques et physiologiques oculaires comparables à celles des humains, telles que la production et le drainage de l’humeur aqueuse 6,7,8,9,10,11,12,13 . Les modèles actuellement utilisés comprennent la sclérose du réseau trabéculaire après injection de solution saline hypertonique dans les veines épisclérales14, l’injection intracamérale de microbilles15 ou de substances viscoélastiques 16, la cautérisation des veines vortex 17, la photocoagulation du réseau trabéculaire avec un laser argon 18, la suture circumlimbique 19 et l’utilisation d’un modèle transgénique d’OHT liée à l’âge (souris DBA/2J)8. Cependant, le caractère invasif, l’opacification postopératoire de la cornée, la perturbation du segment antérieur, les courbes d’apprentissage étendues, l’équipement coûteux et les PIO postopératoires très variables sont quelques-uns des pièges signalés associés aux modèles actuels, ce qui fait du développement d’un modèle alternatif d’OHT une exigence pour surmonter ces problèmes20,21,22.
Le présent protocole formalise une nouvelle intervention chirurgicale pour induire l’OHT en tant qu’indicateur du glaucome, basée sur la cautérisation du plexus limbique (LPC) chez les rongeurs23. Il s’agit d’un modèle simple, reproductible, accessible et non invasif qui offre une grande efficacité et une faible variabilité de l’élévation de la PIO, associée à un taux particulièrement élevé de récupération clinique complète, permettant ainsi une évaluation fonctionnelle in vivo chez un nombre réduit d’animaux utilisés dans chaque expérience. La technique chirurgicale induit une HTO subaiguë avec un retour progressif aux niveaux de base en quelques jours, ce qui modélise l’attaque hypertensive observée dans le glaucome aigu à angle fermé. De plus, la récupération de la PIO dans le modèle est suivie d’une neurodégénérescence glaucomateuse continue, ce qui est utile pour les futures études mécanistiques de la dégénérescence secondaire des CGR, qui se produit dans plusieurs cas de glaucome humain malgré un contrôle adéquat de la PIO.

<table><tbody><tr><td>Acétone</td><td>Isofar</td><td>201</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Électrode active pour l’électrorétinographie</td><td>Hansol Medical</td> <td>Co-Aiguille</td> <td>en acier inoxydable 0,25 mm &times ; 15 mm</td></tr><tr><td>Anestalcon</td><td>Novartis Bioci&ecirc ; ncias S/A</td><td>MS-1.0068.1087</td><td>Chlorhydrate de proxymétacaïne 0,5 %</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Vetec</td><td>560</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Cautérerie Low Temp Fine Tip 10/bx</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td>Cautérisation ophtalmique à basse température</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>000200-3-000003</td><td>Chlorhydrate de kétamine 10 %</td></tr><tr><td>DAKO</td><td>Dako North America</td><td>S3023</td><td>Milieu de montage anti-décoloration</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28718-90-3</td><td>diamidino-2-phénylindole ; contre-coloration nucléaire fluorescente bleue ; émission à 452&plusmn ; 3 nm</td></tr><tr><td>Ecofilm</td><td>Crist&aacute ; lia produtos qu&iacute ; micos Farmac&ecirc ; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0487</td><td>Carmellose sodique 0,5 %</td></tr><tr><td>EPON Resin</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>-</td><td>Résine époxy utilisée pour la microscopie électronique, composée d’un mélange de quatre réactifs : Résine Poly/Bed 812 (CAT#08791) ; DDSA - Anhydride dodécénylsuccinique (CAT#00563) ; NMA - Anhydride de méthyle nadique (CAT#00886) ; DMP-30 - 2,4,6-tris(diméthylaminométhyl)phénol (CAT#00553)</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16110</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Hyabak</td><td>Uni&atilde ; o Qu&iacute ; mica Farmac&ecirc ; utica Nacional S/A</td><td>MS-8042140002</td><td>Hyaluronate de sodium 0,15 %</td></tr> <tr><td>Icare Tonolab</td><td>Icare Finland Oy</td><td>TV02 (numéro de modèle)</td><td>Tonomètre portable à rebond</td></tr><tr><td>IgG âne anti-souris anticorps + Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>Solution d’anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Moniteur LCD 23 pouces</td><td>Samsung Electronics Co. Ltd.</td><td>S23B550</td><td>Modèle LS23B550, pour l’enregistrement par électrorétinogramme</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss-Microscope</td><td></td> <td>à épifluorescence confocal</td></tr><tr><td>Maxiflox</td><td>Crist&aacute ; lia produtos qu&iacute ; micos Farmac&ecirc ; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0489</td><td>Ciprofloxacine 3,5 mg/g</td></tr><tr><td>MEB-9400K</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Système</td> <td>pour l’enregistrement d’électrorétinogrammes</td></tr><tr><td>monoclonal IgG1 souris anti-Brn3a</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB-1585</td><td>Brn3a Solution d’anticorps primaires</td></tr><tr><td>Neuropack Manager v08.33</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Logiciel</td> <td>pour le traitement</td></tr> <tr><td>du signal d’électrorétinogrammeOptomotrie</td><td>cérébraleMécanique</td><td></td> <td>Système pour l’analyse de la réponse optomotrice</td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19100</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>20150</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Électrodes de référence et de masse pour l’électrorétinographie</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>110-63</td><td>Aiguilles en acier inoxydable 0,4 mm & times ; 37 mm</td></tr><tr><td>Tampon de cacodylate de sodium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12300</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Ster MD</td><td>Uni&atilde ; o Qu&iacute ; mica Farmac&ecirc ; utica Nacional S/A</td><td>MS-1.0497.1287</td><td>Acétate de prednisolone 0,12 %</td></tr><tr><td>Terolac</td><td>Crist&aacute ; lia produtos qu&iacute ; micos Farmac&ecirc ; uticos Ltda</td><td>MS-1.0497.1286</td><td>Ketorolac trometamol 0.5 %</td></tr><tr><td>Terramicina</td><td>Laborat&oacute ; rios Pfizer Ltda</td><td>MS-1.0216.0024</td><td>Chlorhydrate d’oxytétracycline 30 mg/g + polymyxine B 10 000 U/g</td></tr><tr><td>Tono-Pen XL</td><td>Reichert Technologies</td><td>230635</td><td>Tonomètre portatif à aplanation numérique</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Contre-coloration nucléaire fluorescente rouge lointain ; émission à 661 nm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Tensioactif non ionique</td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td>Utilisé pour la préparation des tissus en microscopie électronique (étape 5)</td></tr><tr><td>Xilazin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>7899</td><td>Chlorhydrate de xylazine 2 %</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss-Stéréomicroscope</td><td></td> <td>pour la chirurgie et la dissection rétinienne</td></tr></tbody></table>

cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Le glaucome, deuxième cause de cécité dans le monde, est un groupe hétérogène de troubles oculaires caractérisés par des lésions structurelles du nerf optique et une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), entraînant un dysfonctionnement visuel en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau. Une pression intraoculaire élevée est le facteur de risque le plus important ; Ainsi, plusieurs modèles d’hypertension oculaire ont été développés chez les rongeurs par des approches génétiques ou expérimentales pour étudier les causes et les effets de la maladie. Parmi celles-ci, certaines limites ont été signalées, telles que l’invasivité chirurgicale, l’évaluation fonctionnelle inadéquate, la nécessité d’une formation approfondie et l’extension très variable des lésions rétiniennes. Le présent travail caractérise une méthode simple, peu coûteuse et efficace pour induire l’hypertension oculaire chez les rongeurs, basée sur la cautérisation à basse température et en cercle complet du plexus vasculaire limbique, une composante majeure du drainage de l’humeur aqueuse. Le nouveau modèle fournit une hypertension oculaire subaiguë techniquement facile, non invasive et reproductible, associée à un CGR progressif et à une dégénérescence du nerf optique, ainsi qu’un taux de récupération clinique postopératoire unique qui permet des études fonctionnelles in vivo par des méthodes électrophysiologiques et comportementales.

Les variables quantitatives sont exprimées en moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). À l’exception de la comparaison de la dynamique de la PIO entre le groupe OHT et le groupe témoin (figure 1F), l’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Sidak. Une valeur de p &lt; 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
La figure 1 illustre les étapes...

L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Nous avons développé une méthode simple pour induire une dégénérescence robuste et progressive du glaucome basée sur une élévation temporaire de la pression intraoculaire. Il s’agit d’une occasion unique d’étudier les points clés de la physiopathologie du glaucome. Il s’agit d’un modèle facile à apprendre, non invasif, peu coûteux et hautement reproductible qui permet une analyse de la fonction in vivo et des plans expérimentaux à court terme utilisant un nombre réduit d’animaux pour chaque expérience.La rétine et le nerf optique sont des parties évaluables du système nerveux central, de sorte que la modélisation de la déficience progressive de ces structures peut fournir des informations précieuses sur d’autres troubles neurodégénératifs. Pour mesurer la pression intraoculaire initiale, ou PIO, des yeux témoins expérimentaux et controlatéraux, placez le rat anesthésié dans une position de décubitus ventral sur la paillasse, de sorte que la surface cornéenne soit facilement accessible à l’extrémité du tonomètre. Positionnez la pointe du tonomètre de manière à ce qu’elle touche légèrement la zone cornéenne centrale perpendiculairement.Ensuite, acquérez la mesure en appuyant sur le bouton de mesure. Ensuite, placez le rat dans une légère position de décubitus latéral sous un microscope stéréoscopique et inspectez l’œil expérimental à un grossissement de 40 fois. Pendant la procédure, gardez l’œil de contrôle controlatéral lubrifié en instillant une goutte de carmellose sodique ou d’hyaluronate de sodium.Ensuite, à l’aide d’une pince incurvée, poussez doucement le globe oculaire expérimental vers l’avant pour exposer le système vasculaire entourant 360 degrés du limbe. Puis, de l’autre main, à l’aide d’un cautérier ophtalmique à basse température, cautériser doucement les vaisseaux tout autour de la cornée. Attention à ne pas cautériser la périphérie cornéenne.Confirmer le succès de l’intervention chirurgicale en observant l’apparition de petites marques circulaires de cautérisation sur le limbe scléral, l’oblitération du système vasculaire limbique et la dilatation de la pupille dans l’œil opéré. Après la chirurgie, vérifiez la PIO postopératoire immédiate dans les deux yeux, comme démontré précédemment. Ensuite, appliquez une goutte d’acétate ophtalmique de prednisolone sur la surface antérieure de l’œil expérimental.Après 40 secondes, remplacez-le par une pommade antibiotique ophtalmique. Appliquer un suivi clinique quotidien de l’œil expérimental avec des médicaments topiques composés d’un anti-inflammatoire non stéroïdien et d’une pommade antibiotique. Pour l’analyse de la réponse optomotrice, placez le rat pour l’accoutumance sur une plate-forme construite avec quatre écrans d’ordinateur dans un quadrilatère.Maintenez le curseur en forme de croix rouge sur l’image vidéo entre les yeux du rat qui se déplace librement, car il indique le centre du cylindre virtuel. Observer la réponse optomotrice consistant en un suivi réflexe de la tête et du cou du rat provoqué par les gradations rotatives. Dans un premier temps, introduisez un stimulus à faible fréquence spatiale, puis augmentez progressivement la fréquence jusqu’à ce que le mouvement de suivi ne soit pas remarqué.Pour enregistrer l’électrorétinogramme de motif, après avoir anesthésié le rat, insérez soigneusement l’électrode active à la périphérie temporale de la cornée. De plus, insérez l’électrode de référence dans le tissu sous-cutané du canthus temporal ipsilatéral et l’électrode de masse dans l’un des membres postérieurs. Positionnez ensuite le rat à 20 centimètres de l’écran de stimulus, surveillez la ligne de base du signal et lancez l’acquisition en appuyant sur le bouton Analyse du système d’acquisition.Après avoir isolé les rétines, transférez-les dans une plaque de culture à 24 puits contenant un millilitre de PBS, en gardant la rétine interne vers le haut. Perméabiliser le tissu en le lavant avec un tensioactif non ionique à 0,5 % dilué dans du PBS. Ensuite, incubez le tissu et la solution de blocage pendant une heure à température ambiante en agitant doucement.Pendant l’incubation, préparez la solution primaire d’anticorps Brn-3a et conservez-la à quatre degrés Celsius. Après le blocage des tissus, incuber les rétines dans 200 microlitres de solution d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant 72 heures en agitant doucement. Ensuite, lavez le mouchoir avec du PBS.Incuber le tissu dans 200 microlitres de la solution d’anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante, puis avec une solution de contre-coloration nucléaire pendant 10 minutes pour la coloration des noyaux fluorescents. Après trois lavages PBS, transférez la rétine sur une lame de microscope en verre à l’aide de deux petites brosses en maintenant le côté vitré vers le haut. Positionnez le quadrant dorsal de la rétine vers le haut sur la lame de microscope.Enfin, appliquez 200 microlitres de milieu de montage anti-décoloration sur une lamelle de protection en verre et placez-la sur la rétine montée à plat pour une analyse microscopique. À l’aide d’un microscope confocal à épifluorescence, à l’aide d’un objectif grossissant 40 fois, examinez les montures plates pour estimer les cellules ganglionnaires de la rétine. Après l’énucléation du globe oculaire, retirez le segment proximal de la partie intraorbitaire du nerf optique, y compris une partie de la partie intraoculaire.Ensuite, placez immédiatement les échantillons dans des flacons ou des tubes contenant 200 à 300 microlitres de fixateur à froid. Après deux heures, lavez le tissu avec un tampon de cacodylate de sodium à 100 micromolaires froids. Ensuite, post-fixez le tissu pendant une heure dans du tétroxyde d’osmium à 1 % et du chlorure de calcium à cinq nanomolaires à quatre degrés Celsius en agitant doucement.Après trois lavages avec un tampon de cacodylate de sodium froid, lavez les fragments du nerf optique avec de l’eau distillée froide avant d’incuber pendant la nuit et de l’acétate urinoir à 1 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, après trois lavages à l’eau, déshydratez progressivement les tissus en augmentant les concentrations d’acétone. Ensuite, effectuez trois cycles d’enrobage et de solutions d’acétone de résine époxy avant d’enrober le tissu dans de la résine époxy pure pendant 24 heures.Le lendemain, retirez les échantillons du support d’échantillon et transférez-les dans des moules d’enrobage pendant 48 heures à 60 degrés Celsius. Après polymérisation, utiliser un ultra microtome pour couper des sections transversales semi-minces des fragments du nerf optique. Ensuite, collectez et transférez les sections sur une lame de verre de microscope.Teindre les sections avec du bleu de toluidine et les imager à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 100 fois. Pour l’analyse ultra-structurale, effectuez des sections transversales ultra-minces et collectez-les sur une grille en cuivre. Ensuite, colorez les sections avec de l’acétate d’urinoir et du citrate de plomb pour un examen au microscope électronique à transmission.La cautérisation en cercle complet a induit une élévation de la PIO immédiatement après la chirurgie par rapport aux yeux témoins. Le pic de PIO postopératoire a été observé le premier jour et a diminué progressivement jusqu’aux niveaux de base le sixième jour. De plus, la fonction rétinienne a été évaluée à la fois sur le plan comportemental et électrophysiologique à l’aide du réflexe optomoteur et de l’électrorétinogramme, respectivement.Après l’opération, les deux paramètres ont montré deux phases distinctes d’atteinte : une phase aiguë d’hypertension oculaire au troisième jour et une phase de dégénérescence secondaire au 30e jour. Par rapport aux nerfs optiques témoins, la numération axonale et les coupes semi-minces du nerf optique transversal ont diminué progressivement après la chirurgie. Les micrographies électroniques à transmission des nerfs optiques de l’œil témoin ont montré des fibres myélinisées densément emballées séparées par de minces processus de cellules gliales et des microtubules axonaux et des neurofilaments évidents.En revanche, après trois jours d’hypertension oculaire, quelques fibres dégénérées, une vacuolisation cytoplasmique dans les processus cellulaires gliaux et une chromatine condensée dans les noyaux des cellules gliales ont été observées. Après sept jours, il y a eu une augmentation des fibres axonales dégénérées et des processus de cellules gliales hypertoniques. Et après 14 jours, d’autres désarrangements des fibres du nerf optique associés à l’invasion des processus cellulaires gliaux entre les axones ont été observés.De plus, la densité des cellules ganglionnaires de la rétine a diminué avec le temps, principalement dans les quadrants rétiniens dorsal et temporal. Lors de l’exécution de cette procédure, essayez de toucher doucement les vaisseaux limbiques avec une pointe de cautérisation, en épargnant la périphérie du cordon et en veillant à ce que des marques de cautérisation continues soient observées tout autour du limbe scléral. À la suite de cette procédure, diverses méthodes peuvent être appliquées, telles que l’évaluation biochimique fonctionnelle et immunohistochimique des structures oculaires et d’autres méthodes qui peuvent reconnaître la physiopathologie du glaucome.

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