Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Nous avons développé une méthode simple pour induire une dégénérescence robuste et progressive du glaucome basée sur une élévation temporaire de la pression intraoculaire. Il s’agit d’une occasion unique d’étudier les points clés de la physiopathologie du glaucome. Il s’agit d’un modèle facile à apprendre, non invasif, peu coûteux et hautement reproductible qui permet une analyse de la fonction in vivo et des plans expérimentaux à court terme utilisant un nombre réduit d’animaux pour chaque expérience.

La rétine et le nerf optique sont des parties évaluables du système nerveux central, de sorte que la modélisation de la déficience progressive de ces structures peut fournir des informations précieuses sur d’autres troubles neurodégénératifs. Pour mesurer la pression intraoculaire initiale, ou PIO, des yeux témoins expérimentaux et controlatéraux, placez le rat anesthésié dans une position de décubitus ventral sur la paillasse, de sorte que la surface cornéenne soit facilement accessible à l’extrémité du tonomètre. Positionnez la pointe du tonomètre de manière à ce qu’elle touche légèrement la zone cornéenne centrale perpendiculairement.

Ensuite, acquérez la mesure en appuyant sur le bouton de mesure. Ensuite, placez le rat dans une légère position de décubitus latéral sous un microscope stéréoscopique et inspectez l’œil expérimental à un grossissement de 40 fois. Pendant la procédure, gardez l’œil de contrôle controlatéral lubrifié en instillant une goutte de carmellose sodique ou d’hyaluronate de sodium.

Ensuite, à l’aide d’une pince incurvée, poussez doucement le globe oculaire expérimental vers l’avant pour exposer le système vasculaire entourant 360 degrés du limbe. Puis, de l’autre main, à l’aide d’un cautérier ophtalmique à basse température, cautériser doucement les vaisseaux tout autour de la cornée. Attention à ne pas cautériser la périphérie cornéenne.

Confirmer le succès de l’intervention chirurgicale en observant l’apparition de petites marques circulaires de cautérisation sur le limbe scléral, l’oblitération du système vasculaire limbique et la dilatation de la pupille dans l’œil opéré. Après la chirurgie, vérifiez la PIO postopératoire immédiate dans les deux yeux, comme démontré précédemment. Ensuite, appliquez une goutte d’acétate ophtalmique de prednisolone sur la surface antérieure de l’œil expérimental.

Après 40 secondes, remplacez-le par une pommade antibiotique ophtalmique. Appliquer un suivi clinique quotidien de l’œil expérimental avec des médicaments topiques composés d’un anti-inflammatoire non stéroïdien et d’une pommade antibiotique. Pour l’analyse de la réponse optomotrice, placez le rat pour l’accoutumance sur une plate-forme construite avec quatre écrans d’ordinateur dans un quadrilatère.

Maintenez le curseur en forme de croix rouge sur l’image vidéo entre les yeux du rat qui se déplace librement, car il indique le centre du cylindre virtuel. Observer la réponse optomotrice consistant en un suivi réflexe de la tête et du cou du rat provoqué par les gradations rotatives. Dans un premier temps, introduisez un stimulus à faible fréquence spatiale, puis augmentez progressivement la fréquence jusqu’à ce que le mouvement de suivi ne soit pas remarqué.

Pour enregistrer l’électrorétinogramme de motif, après avoir anesthésié le rat, insérez soigneusement l’électrode active à la périphérie temporale de la cornée. De plus, insérez l’électrode de référence dans le tissu sous-cutané du canthus temporal ipsilatéral et l’électrode de masse dans l’un des membres postérieurs. Positionnez ensuite le rat à 20 centimètres de l’écran de stimulus, surveillez la ligne de base du signal et lancez l’acquisition en appuyant sur le bouton Analyse du système d’acquisition.

Après avoir isolé les rétines, transférez-les dans une plaque de culture à 24 puits contenant un millilitre de PBS, en gardant la rétine interne vers le haut. Perméabiliser le tissu en le lavant avec un tensioactif non ionique à 0,5 % dilué dans du PBS. Ensuite, incubez le tissu et la solution de blocage pendant une heure à température ambiante en agitant doucement.

Pendant l’incubation, préparez la solution primaire d’anticorps Brn-3a et conservez-la à quatre degrés Celsius. Après le blocage des tissus, incuber les rétines dans 200 microlitres de solution d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant 72 heures en agitant doucement. Ensuite, lavez le mouchoir avec du PBS.

Incuber le tissu dans 200 microlitres de la solution d’anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante, puis avec une solution de contre-coloration nucléaire pendant 10 minutes pour la coloration des noyaux fluorescents. Après trois lavages PBS, transférez la rétine sur une lame de microscope en verre à l’aide de deux petites brosses en maintenant le côté vitré vers le haut. Positionnez le quadrant dorsal de la rétine vers le haut sur la lame de microscope.

Enfin, appliquez 200 microlitres de milieu de montage anti-décoloration sur une lamelle de protection en verre et placez-la sur la rétine montée à plat pour une analyse microscopique. À l’aide d’un microscope confocal à épifluorescence, à l’aide d’un objectif grossissant 40 fois, examinez les montures plates pour estimer les cellules ganglionnaires de la rétine. Après l’énucléation du globe oculaire, retirez le segment proximal de la partie intraorbitaire du nerf optique, y compris une partie de la partie intraoculaire.

Ensuite, placez immédiatement les échantillons dans des flacons ou des tubes contenant 200 à 300 microlitres de fixateur à froid. Après deux heures, lavez le tissu avec un tampon de cacodylate de sodium à 100 micromolaires froids. Ensuite, post-fixez le tissu pendant une heure dans du tétroxyde d’osmium à 1 % et du chlorure de calcium à cinq nanomolaires à quatre degrés Celsius en agitant doucement.

Après trois lavages avec un tampon de cacodylate de sodium froid, lavez les fragments du nerf optique avec de l’eau distillée froide avant d’incuber pendant la nuit et de l’acétate urinoir à 1 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, après trois lavages à l’eau, déshydratez progressivement les tissus en augmentant les concentrations d’acétone. Ensuite, effectuez trois cycles d’enrobage et de solutions d’acétone de résine époxy avant d’enrober le tissu dans de la résine époxy pure pendant 24 heures.

Le lendemain, retirez les échantillons du support d’échantillon et transférez-les dans des moules d’enrobage pendant 48 heures à 60 degrés Celsius. Après polymérisation, utiliser un ultra microtome pour couper des sections transversales semi-minces des fragments du nerf optique. Ensuite, collectez et transférez les sections sur une lame de verre de microscope.

Teindre les sections avec du bleu de toluidine et les imager à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 100 fois. Pour l’analyse ultra-structurale, effectuez des sections transversales ultra-minces et collectez-les sur une grille en cuivre. Ensuite, colorez les sections avec de l’acétate d’urinoir et du citrate de plomb pour un examen au microscope électronique à transmission.

La cautérisation en cercle complet a induit une élévation de la PIO immédiatement après la chirurgie par rapport aux yeux témoins. Le pic de PIO postopératoire a été observé le premier jour et a diminué progressivement jusqu’aux niveaux de base le sixième jour. De plus, la fonction rétinienne a été évaluée à la fois sur le plan comportemental et électrophysiologique à l’aide du réflexe optomoteur et de l’électrorétinogramme, respectivement.

Après l’opération, les deux paramètres ont montré deux phases distinctes d’atteinte : une phase aiguë d’hypertension oculaire au troisième jour et une phase de dégénérescence secondaire au 30e jour. Par rapport aux nerfs optiques témoins, la numération axonale et les coupes semi-minces du nerf optique transversal ont diminué progressivement après la chirurgie. Les micrographies électroniques à transmission des nerfs optiques de l’œil témoin ont montré des fibres myélinisées densément emballées séparées par de minces processus de cellules gliales et des microtubules axonaux et des neurofilaments évidents.

En revanche, après trois jours d’hypertension oculaire, quelques fibres dégénérées, une vacuolisation cytoplasmique dans les processus cellulaires gliaux et une chromatine condensée dans les noyaux des cellules gliales ont été observées. Après sept jours, il y a eu une augmentation des fibres axonales dégénérées et des processus de cellules gliales hypertoniques. Et après 14 jours, d’autres désarrangements des fibres du nerf optique associés à l’invasion des processus cellulaires gliaux entre les axones ont été observés.

De plus, la densité des cellules ganglionnaires de la rétine a diminué avec le temps, principalement dans les quadrants rétiniens dorsal et temporal. Lors de l’exécution de cette procédure, essayez de toucher doucement les vaisseaux limbiques avec une pointe de cautérisation, en épargnant la périphérie du cordon et en veillant à ce que des marques de cautérisation continues soient observées tout autour du limbe scléral. À la suite de cette procédure, diverses méthodes peuvent être appliquées, telles que l’évaluation biochimique fonctionnelle et immunohistochimique des structures oculaires et d’autres méthodes qui peuvent reconnaître la physiopathologie du glaucome.