Name: Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Apprenez à isoler des champignons du sol pour la biodégradation des polluants récalcitrants. Ce protocole de dépistage évalue le potentiel de bioremédiation par des tests enzymatiques sur pétrolatum, huile usagée et plastiques.

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Nous remercions la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de l’Université de Pavie et le professeur Solveig Tosi pour avoir fourni l’opportunité de ce travail.

1. Sélection de souches fongiques capables de dégrader les matières récalcitrantes du sol
<ol><li>Préparation de la solution antibiotique.<ol>
<li>Mettre la pénicilline (50 mg/L), la streptomycine (40 mg/L), la chlortétracycline (40 mg/L), la néomycine (100 mg/L) et le chloramphénicol (100 mg/L) dans 250 mL d’eau stérile désionisée.</li>
		<li>Avant d’ajouter du chloramphénicol à la solution antibiotique, dissolvez-le dans 3 mL d’éthanol à ≥99 %.</li>
		<li>Placez la solution antibiotique sur un agitateur magnétique (sans chaleur) avec une barre d’agitation magnétique à l’intérieur de la solution pendant 10 min. Conservez-le à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des milieux de croissance.<ol>
<li>Mettez 1 g d’acide humique commercial, 3,26 g de bouillon Bushnell-Haas (BH) et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et autoclavez-le pendant 20 min à 121 °C (gélose à l’acide humique).</li>
		<li>Plaquer la gélose à l’acide humique dans des boîtes de Pétri sous une armoire à flux laminaire.</li>
		<li>Mettre 4 g de lignocellulose, 3,26 g de BH et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et l’autoclaver pendant 20 min à 121 °C (gélose à lignocellulose).</li>
		<li>Plaquer la gélose en lignocellulose dans des boîtes de Petri sous une armoire à flux laminaire.</li>
		<li>Sous une armoire à flux laminaire, une fois que le support s’est solidifié dans les boîtes de Pétri, transférer 1 mL de la solution antibiotique sur les plaques préparées à l’aide d’une seringue stérile avec un filtre de 0,2 μm pour la stériliser.</li>
		<li>Répartissez la solution antibiotique uniformément sur les surfaces de la plaque à l’aide d’un épandeur de cellules stérile jetable en forme de L et laissez-la sécher à l’air libre sous l’armoire à flux laminaire.</li>
		<li>Mettre 20 g de bouillon d’extrait de malt et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et autoclaver pendant 20 min à 121 °C (gélose à l’extrait de malt - MEA).</li>
		<li>Plaquez le MEA dans des boîtes de Petri sous une armoire à flux laminaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Échantillonnage et dilution du sol.<ol>
<li>Échantillonnez le sol d’intérêt à une profondeur de 10 cm, en enlevant les plantes, l’herbe et les feuilles mortes de la couche supérieure, et mettez-le dans des sacs en polyéthylène stériles.</li>
		<li>Après avoir atteint le laboratoire, tamisez le sol à l’aide d’un maillage de 2 mm, en enlevant les racines et les débris végétaux.</li>
		<li>S’il n’est pas possible de procéder immédiatement à l’analyse en aval, stocker les échantillons de sol tamisés à 4 °C.</li>
		<li>En travaillant sous une armoire à écoulement laminaire, mettre 1 g de sol tamisé dans un tube stérile de 15 mL avec 10 mL d’eau désionisée stérile (1 x 10-1 dilution). Agiter le tube horizontalement pendant 30 min.</li>
		<li>Sous une armoire à écoulement laminaire, avant que la suspension ne se dépose, prendre 1 mL de la dilution 1 x 10-1 avec une pipette stérile et la transférer dans un vide d’eau désionisée de 9 mL (dilution 1 x 10-2 ). Vortex à fond.</li>
		<li>Avant que la suspension ne se dépose, prendre 1 mL de la dilution 1 x 10-2 avec une pipette stérile et transférer dans un vide d’eau désionisée de 9 mL (dilution 1 x 10-3 ). Vortex à fond.</li>
	</ol></li>
	<li>Placage des dilutions du sol sur des milieux sélectifs.<ol>
<li>En travaillant sous une armoire à flux laminaire, collectez 100 μL de la dilution 1 x 10-3 à l’aide d’une micropipette avec un point stérile et transférez-la sur une boîte de Petri à gélose humique. Faites-le pour au moins 4 ou 5 boîtes de Pétri.</li>
		<li>Répartissez la dilution uniformément sur la surface de la boîte de Pétri à l’aide d’un épandeur de cellules stérile jetable en forme de L.</li>
		<li>Laissez-le sécher à l’air libre pendant 10-15 min sous l’armoire à flux laminaire.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.4.1.-1.4.3. en utilisant des boîtes de Petri en lignocellulose.</li>
		<li>Incuber à 25 °C dans l’obscurité pendant un maximum de 15 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement des colonies fongiques cultivées de milieux sélectifs à milieux de croissance.<ol>
<li>À partir de 3 jours après la préparation, vérifiez quotidiennement les boîtes de Petri préparées pour détecter toute croissance de colonie fongique pendant un maximum de 15 jours.</li>
		<li>Vérifiez toutes les colonies fongiques présentes pour les similitudes. Si nécessaire, préparez une lame à observer au microscope optique. REMARQUE: L’objectif est d’isoler le plus grand nombre de colonies fongiques, mais il est nécessaire d’éviter de toujours isoler la même souche fongique de différentes plaques, cette vérification est donc très importante. Recherchez des colonies avec une macro et une micromorphologie différentes.</li>
		<li>Sous une armoire à écoulement laminaire ou à un brûleur Bunsen, isolez chaque souche fongique choisie en retirant doucement une petite partie du mycélium de la colonie avec une aiguille d’inoculation stérile et en la transférant dans une nouvelle boîte de Petri MEA. REMARQUE: Dans cette phase, il est très important d’être délicat et précis car il existe un risque élevé de contamination par les autres colonies fongiques présentes dans la boîte de Pétri d’origine. Si plus d’une souche fongique se développe sur la plaque MEA inoculée, répétez l’étape 1.5.3.</li>
		<li>Incuber à 25 °C dans l’obscurité pendant 7 jours. Ce sont les souches fongiques à tester davantage sur des substances récalcitrantes spécifiques.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tests de croissance sur substances récalcitrantes
<ol><li>Test de croissance sur la vaseline.<ol>
<li>Transférer 20 mL de BH liquide (3,26 g/L de BH) dans des flacons de 50 mL et les stériliser par autoclavage à 121 °C pendant 20 min.</li>
		<li>Transférer 7 mL d’eau désionisée dans des flacons en verre de 15 mL et ajouter quelques morceaux de couvercles en verre brisé dans chaque flacon.</li>
		<li>Stérilisez-les par autoclavage à 121 °C pendant 20 min.</li>
		<li>Sous l’armoire à écoulement laminaire, ajouter 1 mL de vaseline à chaque flacon BH de 50 mL à l’aide d’une pipette stérile. Gardez quelques flacons avec seulement BH comme contrôle négatif.</li>
		<li>Sous l’armoire à écoulement laminaire, retirer le mycélium à la surface du milieu des plaques MEA avec les souches fongiques choisies (préparées à l’étape 1.5.3.) à l’aide d’une aiguille stérile et le transférer dans des flacons en verre de 15 mL avec les couvercles cassés.</li>
		<li>Agiter chaque flacon sur un mélangeur vortex pendant 2 min, en permettant aux couvercles cassés de couper le cube de la colonie fongique, en faisant une suspension fongique.</li>
		<li>Inoculer chaque flacon de vaseline avec 200 μL de suspension fongique. Faites deux répliques pour chaque souche fongique.</li>
		<li>Pour le contrôle négatif, mettre 200 μL de suspension fongique dans des flacons contenant uniquement du BH liquide. De plus, conservez quelques flacons avec de la vaseline sans aucune inoculation fongique pour vérifier la contamination du milieu.</li>
		<li>Incuber les flacons à 25 °C dans l’obscurité et vérifiez-les après 15 jours et 30 jours à partir de l’inoculum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test de croissance sur huile moteur usagée.<ol>
<li>Mettre 3,26 g de BH et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et autoclaver pendant 20 min à 121 °C (BHA).</li>
		<li>Plaquez le BHA dans des boîtes de Petri sous une armoire à flux laminaire.</li>
		<li>Lorsqu’elle s’est solidifiée, transférez 500 μL d’huile moteur usagée sur les boîtes de Petri BHA et répartissez-la uniformément sur les surfaces des plaques à l’aide d’un épandeur de cellules stérile jetable en forme de L.</li>
		<li>Inoculer chaque plaque BHA d’huile moteur usagée avec chaque souche fongique, en recueillant le mycélium des plaques préparées à l’étape 1.5.3. Travaillez sur un brûleur Bunsen ou sous une hotte à écoulement laminaire pour éviter toute contamination. Faites deux répliques pour chaque souche fongique.</li>
		<li>Pour le contrôle négatif, inoculez les boîtes de Petri avec du BHA uniquement. De plus, conservez quelques boîtes de Petri BHA d’huile moteur usagées sans aucune inoculation fongique pour vérifier la contamination du milieu.</li>
		<li>Incuber les boîtes de Petri à 25 °C dans l’obscurité et vérifiez-les après 15 jours et 30 jours à partir de l’inoculum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test de croissance sur les plastiques.<ol>
<li>Transférer 200 μL de suspension fongique (étapes 2.1.5.-2.1.6.) dans une plaque de 96 micropuits. Faites trois répliques de la combinaison de déformation fongique et de plastique.</li>
		<li>À chaque puits avec la suspension fongique, ajouter 10 mg d’un type différent de poudre plastique (polyéthylène téréphtalate - PET, polychlorure de vinyle - PVC, polyéthylène haute densité - PEHD, polystyrène - PS, polyuréthane - PUR).</li>
		<li>Pour le contrôle négatif, au lieu d’ajouter la poudre de plastique, ajoutez 200 μL de solution de BH stérilisée au puits avec la suspension fongique. De plus, pour chaque type de poudre plastique, remplissez un puits avec 200 μL de solution de BH stérilisée et 10 mg de chaque poussière plastique pour vérifier la contamination du milieu.</li>
		<li>Incuber les plaques de micropuit à 25 °C dans l’obscurité et vérifiez-les après 15 jours et 30 jours à partir de l’inoculum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tests enzymatiques qualitatifs
<ol><li>Test colorimétrique qualitatif des enzymes ligninolytiques.<ol>
<li>Mettre 27 g de bouillon de dextrose de pomme de terre () et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et autoclaver pendant 20 min à 121 °C (PDA).</li>
		<li>Lorsque le milieu a refroidi un peu mais qu’il est encore liquide, ajouter de l’acide gallique (5 g/L) sous une hotte à écoulement laminaire et plaquer le milieu dans des boîtes de Pétri.</li>
		<li>Inoculer les plaques de PDA + acide gallique avec chaque souche fongique, en recueillant le mycélium des plaques préparées à l’étape 1.5.3. Travaillez sur un brûleur Bunsen ou sous une hotte à écoulement laminaire pour éviter toute contamination.</li>
		<li>En tant que témoins négatifs, préparez des boîtes de Petri avec seulement du PDA (pas d’acide gallique) et inoculez-les avec les souches fongiques (une pour chaque souche fongique), ainsi qu’une boîte de Petri avec PDA + acide gallique et sans inoculation fongique.</li>
		<li>Incuber les boîtes de Petri à 25 °C dans l’obscurité et vérifiez-les après 7 jours à partir de l’inoculum.</li>
	</ol></li>
	<li>Test colorimétrique qualitatif des laccases.<ol>
<li>Mettre 27 g de et 15 g de gélose dans 1 L d’eau désionisée et autoclaver pendant 20 min à 121 °C (PDA).</li>
		<li>Lorsque le milieu a refroidi un peu mais qu’il est encore liquide, ajouter le guaiacol (400 μL/L) sous une hotte à écoulement laminaire et le plaquer dans des boîtes de Pétri.</li>
		<li>Inoculer les plaques PDA + guaiacol avec chaque souche fongique, en recueillant le mycélium des plaques préparées à l’étape 1.5.3. Travaillez sur un brûleur Bunsen ou sous une hotte à écoulement laminaire pour éviter toute contamination.</li>
		<li>En tant que témoins négatifs, préparez des boîtes de Petri avec seulement du PDA (pas de guaiacol) et inoculez-les avec les souches fongiques (une pour chaque souche fongique), ainsi qu’une boîte de Petri avec PDA + guaiacol et sans inoculation fongique.</li>
		<li>Incuber les boîtes de Petri à 25 °C dans l’obscurité et vérifiez-les après 7 jours à partir de l’inoculum.</li>
	</ol></li>
	<li>Test qualitatif des protéases.<ol>
<li>Préparer le milieu YES en ajoutantK2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) et gélatine/peptone (0,02 g/L) à l’eau désionisée.</li>
		<li>Placez le milieu YES sur un agitateur magnétique (pas de chaleur) avec une barre d’agitation magnétique à l’intérieur du milieu pendant 10 min.</li>
		<li>Lorsque tous les sels sont dissous dans le milieu, transférer 5 mL de la solution dans des flacons en verre stérile de 20 mL et les autoclaver pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Pour le contrôle négatif, préparer des flacons en verre stérile de 20 mL avec 5 mL de solution de BH et les autoclaver pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Sous une armoire à écoulement laminaire, transférer 200 μL de suspension fongique (étapes 2.1.5.-2.1.6.) pour chaque souche dans les flacons stérilisés du milieu YES (faire au moins 2 répliques par souche fongique). Pour chaque souche fongique, ajouter 200 μL de la même suspension fongique aux flacons stérilisés BH pour avoir un contrôle négatif.</li>
		<li>Incuber les flacons à 25 °C dans l’obscurité pendant 21 jours et vérifiez-les tous les 7 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Test qualitatif des estérases.<ol>
<li>Préparer le milieu Tween 80 en ajoutant de la peptone (10 g/L), du NaCl (5 g/L), du CaCl2 (0,1 g/L) et 10 mL d’eau désionisée Tween 80 à 1 L.</li>
		<li>Placez le milieu Tween 80 sur un agitateur magnétique (sans chaleur) avec une barre d’agitation magnétique à l’intérieur du milieu pendant 10 min.</li>
		<li>Lorsque tout est fondu à l’intérieur du milieu, transférer 5 mL de la solution dans des flacons en verre stérile de 20 mL et les autoclaver pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Pour le contrôle négatif, préparer des flacons en verre stérile de 20 mL avec 5 mL de solution de BH et les autoclaver pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Sous une armoire à écoulement laminaire, transférer 200 μL de suspension fongique (étapes 2.1.5.-2.1.6.) pour chaque souche vers les flacons moyennement stérilisés Tween 80 (faire au moins 2 répliques par souche fongique). Pour chaque souche fongique, ajouter 200 μL de la même suspension fongique aux flacons stérilisés BH pour un contrôle négatif.</li>
		<li>Incuber les flacons à 25 °C dans l’obscurité pendant 21 jours et vérifiez-les tous les 7 jours.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La riche biodiversité des sols est une source abondante de champignons qui possèdent de nombreuses capacités métaboliques, dont certaines pourraient être des candidats potentiels pour la bioremédiation. Les tests sélectifs des milieux (section 1 du protocole) sont des méthodes faciles à réaliser et efficaces pour isoler les champignons capables de se développer sur des polymères complexes naturels comme seule source de carbone. Les champignons peuvent produire des hydrolases extracellulaires non spécifiques et des oxydor...

Le sol est une composante fondamentale de la vie sur Terre et est à la base de nombreux écosystèmes. Les minéraux, la matière organique et les micro-organismes dans le sol peuvent être considérés comme un seul système, avec des associations et des interactions étroites se produisant entre eux. Les interactions de ces composés ont un impact important sur les processus terrestres, la qualité de l’environnement et la santé des écosystèmes1. La pollution des sols pose de graves problèmes environnementaux dans le monde entier. L’application aveugle, à long terme et excessive de substances récalcitrantes et toxiques, telles que les pesticides, les produits pétroliers, les plastiques et d’autres produits chimiques, a de graves effets sur l’écologie des sols et, par conséquent, peut altérer le microbiote des sols. Les communautés microbiennes dans les sols sont composées d’un large éventail d’organismes dans différents états physiologiques, la majorité étant des bactéries et des champignons. De nombreux contaminants dans les sols ont une stabilité à moyen et à long terme, et leur persistance peut conduire au développement de mécanismes adaptatifs qui permettent aux micro-organismes d’utiliser des substances récalcitrantes comme nutriments 2,3. Ces micro-organismes peuvent donc être pris en compte pour les techniques de bioremédiation.
La bioremédiation tente d’atténuer les effets de la pollution en utilisant des micro-organismes et leurs enzymes pour la dégradation ou la transformation des déchets en composés moins toxiques ou non toxiques. Diverses espèces d’archées, de bactéries, d’algues et de champignons possèdent cette capacité de bioremédiation4. En raison de leurs actions biodégradables particulières, les champignons sont des organismes particulièrement prometteurs pour la bioremédiation. Ils peuvent attaquer différents substrats en utilisant leur réseau hyphalique, ce qui leur permet de pénétrer dans la matrice du sol plus efficacement que les autres micro-organismes. De plus, ils peuvent atteindre des interstices inaccessibles où les contaminants sont difficiles à éliminer5, et ils peuvent également survivre à de faibles niveaux d’humidité6. De plus, les champignons synthétisent différentes cassettes d’enzymes non spécifiques, généralement pour dégrader les substances récalcitrantes naturelles telles que la cellulose, la lignine et les acides humiques. Ceux qui n’ont pas le substrat cible peuvent être impliqués dans la dégradation d’un large éventail de polluants récalcitrants, tels que les hydrocarbures, les plastiques et les pesticides 7,8,9,10. Par conséquent, bien que de nombreuses espèces fongiques aient déjà été signalées comme agents de bioremédiation, il y a un intérêt croissant pour l’exploration d’espèces qui n’ont pas encore été étudiées afin de sélectionner des candidats pour la bioremédiation de substances contaminantes récalcitrantes. Les espèces déjà connues pour avoir des propriétés de bioremédiation appartiennent au phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 et Mucoromycota. Par exemple, les genres Penicillium et Aspergillus sont bien connus pour être impliqués dans la dégradation des hydrocarbures aliphatiques13, des différents polymères plastiques 16,17,18, des métaux lourds 19 et des colorants20. De même, des études menées sur les champignons basidiomycètes, tels que Phanerochaete chrysosporium et Trametes versicolor, ont révélé leur implication dans l’oxydation de matériaux récalcitrants tels que les hydrocarbures aromatiques13 et les plastiques21. Un autre exemple de champignons impliqués dans les processus de biodégradation sont les zygomycètes Rhizopus spp., Mucor spp. et Cunninghamella spp.22,23. En particulier, Cunninghamella est capable d’oxyder les hydrocarbures aromatiques et est considéré comme un organisme modèle pour l’étude de la désintoxication des produits d’une large gamme de xénobiotiques13.
Il existe plusieurs enzymes fongiques impliquées dans les principaux processus de dégradation des matériaux récalcitrants24,25, tels que l’estérase, la laccase, la peroxydase et la protéase. Les laccases sont des oxydases contenant du cuivre produites dans la cellule et sécrétées par la suite, qui permettent l’oxydation d’une variété de composés phénoliques et aromatiques. Ils peuvent dégrader les ortho et para diphénols, les phénols contenant le groupe aminé, la lignine et les diamines contenant le groupe aryle26. Les peroxydases utilisent le peroxyde d’hydrogène comme médiateur pour dégrader la lignine et d’autres composés aromatiques. Il existe de nombreuses peroxydases différentes, mais celles qui ont le plus grand potentiel de dégrader les substances toxiques sont la lignine peroxydase et la peroxydase de manganèse27.
Les estérases et les protéases appartiennent au groupe des enzymes extra- ou ecto-cellulaires, qui agissent en dehors de leurs cellules d’origine mais y sont toujours liées. Ces enzymes peuvent catalyser l’hydrolyse de grosses molécules récalcitrantes en molécules plus petites. En raison de leur faible spécificité de substrat, ces enzymes peuvent jouer un rôle clé dans la bioremédiation de divers polluants, tels que les colorants textiles, les effluents libérés par les industries des pâtes et papiers et le tannage du cuir, les produits pétroliers, les plastiques et les pesticides 28,29,30.
Un certain nombre de méthodes de dépistage pour sélectionner les souches fongiques biorémédiatrices ont déjà été publiées. Par exemple, un milieu d’agar à base de paille a été utilisé pour dépister les champignons de pourriture blanche à fort potentiel dans la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)31; et de petits morceaux de bois en décomposition ont été placés sur de la gélose à l’extrait de malt (MEA) pour isoler les champignons pourrissantsdu bois 32. Cependant, la plupart des méthodes qui ont déjà été proposées sélectionnent des champignons très spécifiques pour leur activité d’intérêt. Cette recherche propose une approche plus large pour sélectionner les champignons du sol avec un plus large éventail d’actions. La méthode repose sur le placage initial de dilutions en série d’échantillons de sol sur un milieu modifié avec des acides humiques ou de la lignocellulose mélangée à des antibiotiques pour sélectionner des champignons capables de dégrader ces substances récalcitrantes naturelles. Les acides humiques et la lignocellulose, en fait, sont des substances extrêmement résistantes à la biodégradation car elles ont des structures moléculaires très complexes, ce qui leur permet d’être d’excellents indicateurs de la capacité de dégradation des champignons testés33,34. Par la suite, les champignons sélectionnés lors des premiers essais sont passés au crible pour identifier ceux qui ont le potentiel de dégrader des polluants spécifiques tels que la vaseline, l’huile moteur usagée et les plastiques. Enfin, des tests enzymatiques qualitatifs sont effectués pour détecter les souches fongiques capables de produire des enzymes impliquées dans les processus de biodégradation des substances récalcitrantes. À cette fin, des tests de protéase et d’estérase sont effectués, tandis que l’acide gallique et le guaiacol sont utilisés comme indicateurs de la production de laccase et d’autres enzymes ligninolytiques35,36. Ces substrats sont utilisés parce qu’une forte corrélation a été trouvée entre la capacité des champignons à les oxyder à leur forme de couleur brune et la possession de la capacité ligninolytique 37,38,39.
Grâce à ces protocoles, il est possible d’isoler des souches fongiques à fort potentiel de dégradation et à large spectre d’action directement à partir d’échantillons de sol. L’isolement de ces souches fongiques pourrait aider à trouver de nouveaux candidats à des fins de bioremédiation.

<table><tbody><tr><td>96 plaque à micropuits</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Bushnell-Haas Broth</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Chloroamphénicol</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Chlortétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot ; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot ; 6H2O</td> Filtre <td>236489</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>0.2 &micro ; m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>acide gallique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles en verre</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène haute densité (PEHD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Acides humiques</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocellulose</td><td>/</td><td>/</td><td>Déchets de production de bioéthanol stérilisé</td></tr><tr><td>Épandeur de cellules en forme de L</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>agitateur magnétique</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon d’extrait</td><td>de malt Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot ; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &mu ; L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 200&nbsp ; &mu ; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot ; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Néomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène téréphtalate (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Pétrolatum (paraffine liquide)</td><td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr> 009661 <tr><td>Pomme de terre Bouillon de dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Polyuréthane (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>Polychlorure de vinyle ( PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Tube de faucon stérile</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre stérile 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Point stérile 1000&nbsp ; &mu ; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Point stérile 200&nbsp ; &mu ; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Sacs stériles en polyéthylène</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>seringue stérile</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Huile moteur usagée</td><td>/</td><td>/</td><td>mélange complexe d’hydrocarbures, d’additifs pour moteurs et de métaux, fourni par une société privée italienne</td></tr><tr><td>Flacons 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

La pollution de l’environnement est un problème croissant, et l’identification des champignons impliqués dans le processus de bioremédiation est une tâche essentielle. Le sol abrite une incroyable diversité de vie microbienne et peut être une bonne source de ces champignons biorémédiateurs. Ce travail vise à rechercher des champignons du sol ayant un potentiel de bioremédiation en utilisant différents tests de dépistage. Des milieux de culture minéraux complétés par des substances récalcitrantes comme seule source de carbone ont été utilisés comme tests de croissance. Tout d’abord, les dilutions du sol ont été plaquées sur des boîtes de Pétri avec un milieu minéral amendé avec des acides humiques ou de la lignocellulose. Les colonies fongiques en croissance ont été isolées et testées sur différents substrats, tels que des mélanges complexes d’hydrocarbures (vaseline et huile moteur usagée) et des poudres de différents polymères plastiques (PET, PP, PS, PUR, PVC). Des tests enzymatiques qualitatifs ont été associés aux tests de croissance pour étudier la production d’estérases, de laccases, de peroxydases et de protéases. Ces enzymes sont impliquées dans les principaux processus de dégradation du matériel récalcitrant, et leur sécrétion constitutive par les souches fongiques examinées pourrait avoir le potentiel d’être exploitée pour la bioremédiation. Plus de 100 souches ont été isolées et testées, et plusieurs isolats présentant un bon potentiel de bioremédiation ont été trouvés. En conclusion, les tests de dépistage décrits sont une méthode facile et peu coûteuse pour identifier les souches fongiques ayant un potentiel de bioremédiation du sol. En outre, il est possible d’adapter les tests de dépistage pour différents polluants, en fonction des besoins, en ajoutant d’autres substances récalcitrantes à des milieux de culture minimaux.

Les méthodes de milieux sélectifs (section 1 du protocole) ont permis de passer au crible la riche biodiversité du sol et de sélectionner les champignons à fort potentiel de bioremédiation. Avec l’acide humique et la lignocellulose, plus de 100 souches fongiques ont été isolées. Ces champignons ont produit des enzymes impliquées dans la biodégradation des matériaux récalcitrants naturels, qui ont une structure chimique ressemblant à de nombreux polluants. Cependant, les souches fongiques isolées avec le milieu sélectif n...

Nous présentons ici un protocole de criblage de la biodiversité des sols afin de rechercher les souches fongiques impliquées dans la dégradation des matériaux récalcitrants. Tout d’abord, les souches fongiques capables de se développer sur les acides humiques ou la lignocellulose sont isolées. Leur activité est ensuite testée à la fois dans des essais enzymatiques et sur des polluants tels que les hydrocarbures et les plastiques.

Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Ce protocole est important parce qu’il isole des souches fongiques à fort potentiel de dégradation directement à partir d’échantillons de sol pour être considérées comme candidates à des fins de bioremédiation. Ce protocole est un dépistage peu coûteux pour trouver des champignons ayant un potentiel de bioremédiation. De plus, il donne des résultats faciles à interpréter.Étant donné que cette technique implique la manipulation de micro-organismes, il est très important de travailler en stérilité à l’aide d’une armoire à flux laminaire ou d’un brûleur Bunsen pour éviter toute contamination. Pour commencer, échantillonnez le sol d’intérêt et tamisez le sol à l’aide d’un maillage de deux millimètres pour enlever les racines et les débris végétaux. Sous une armoire à écoulement laminaire, ajoutez un gramme de terre tamisée dans un tube stérile de 15 millilitres.Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’eau désionisée stérile pour faire un 10 à la dilution moins un. Agiter le tube horizontalement pendant 30 minutes. Avant que la suspension ne se dépose, prendre un millilitre de 10 à la dilution moins une avec une pipette stérile et le transférer dans un blanc d’eau désionisée de neuf millilitres pour faire 10 à la dilution moins deux.Vortex la suspension à fond. De même, faites une dilution de 10 à moins trois d’un tube de dilution de 10 à moins deux. Pour le placage des dilutions du sol sur des milieux sélectifs, recueillir 100 microlitres de la dilution 10 à moins trois à l’aide d’une micropipette avec un point stérile et le transférer sur une boîte de Petri à gélose humique.Répartissez la dilution uniformément sur la surface du plat à l’aide d’un épandeur de cellules stérile, jetable et en forme de L. Préparez quatre à cinq plats de ce type. De même, préparez des plats en lignocellulose à partir d’un tube de dilution de 10 à moins trois.Laissez la vaisselle sécher à l’air libre pendant 10 à 15 minutes avant d’incuber à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 15 jours. Vérifiez toutes les colonies fongiques présentes pour les similitudes. Si nécessaire, préparez une lame à observer au microscope optique.Sous une armoire à écoulement laminaire ou à un brûleur Bunsen, isolez chaque souche fongique choisie en retirant doucement une petite partie du mycélium de la colonie avec une aiguille d’inoculation stérile. Transférer la colonie isolée dans un nouveau plat d’agar à l’extrait de malt, ou MEA. Transférer 20 millilitres de Bushnell Haas, ou milieu BH, dans des flacons en verre de 50 millilitres.Transférer sept millilitres d’eau désionisée dans des flacons de 15 millilitres et ajouter des morceaux de couvercle en verre brisé glissés dans chaque flacon. Stériliser les flacons en autoclavant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour tester la croissance sur la vaseline, ajoutez un millilitre de vaseline à chaque flacon BH de 50 millilitres à l’aide d’une pipette stérile sous l’armoire à écoulement laminaire.Gardez quelques flacons avec seulement BH comme contrôle négatif. Retirer le mycélium à la surface du milieu de la plaque MEA avec la souche fongique choisie à l’aide d’une aiguille stérile et le transférer dans un flacon en verre de 15 millilitres avec les glissières de couvercle cassées. Agiter le flacon sur un mélangeur vortex pendant deux minutes, en laissant le couvercle cassé glisser pour couper le cube de la colonie fongique, en faisant une suspension.Inoculez chaque flacon de vaseline avec une suspension de 200 microlitres. Faites deux répliques pour chaque souche fongique. Pour le contrôle négatif, ajouter 200 microlitres de suspension fongique dans le flacon contenant uniquement du milieu BH.De plus, conservez le flacon avec de la vaseline sans aucune inoculation fongique pour vérifier la contamination du milieu. Incuber les flacons à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après 15 et 30 jours à partir de l’inoculum. Pour tester la croissance sur l’huile moteur usagée, transférez 500 microlitres d’huile moteur usagée sur la boîte de Petri BHA et répartissez l’huile uniformément.Ensuite, inoculez la plaque avec une souche fongique en recueillant le mycélium des plaques MEA. Pour tester la croissance sur les plastiques, transférez 200 microlitres de suspension fongique dans une plaque de 96 micropuits. Faites trois répliques de la combinaison de déformation fongique et de plastique.Ajouter 10 milligrammes d’une poudre de plastique différente à chaque puits avec la suspension fongique. Pour le contrôle négatif, ajoutez 200 microlitres de milieu BH au puits avec la suspension fongique. De plus, pour chaque poudre de plastique, remplissez un puits avec 200 microlitres de solution de BH et 10 milligrammes de chaque poussière de plastique pour vérifier la contamination.Incuber les plaques à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après 15 et 30 jours. Pour le test calorimétrique qualitatif des laccases, préparez un litre de gélose au dextrose de pomme de terre, ou PDA, et autoclavez pendant 20 minutes. Après l’autoclavage, lorsque le fluide a refroidi mais est encore liquide, ajoutez 400 microlitres de guaiacol sous une hotte à flux laminaire et plaquez-le dans des boîtes de Pétri.Inoculer la plaque de guaiacol PDA avec une souche fongique en recueillant le mycélium de la plaque MEA. Pour les témoins négatifs, préparez des plaques de PDA avec chaque souche fongique et une plaque avec du PDA et du guaiacol. Incuber les plaques à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après sept jours.Pour le test qualitatif des estérases, préparez un litre de Tween 80 medium. Ensuite, placez le milieu sur un agitateur magnétique sans chauffer avec une barre d’agitation à l’intérieur du milieu. Après 10 minutes, lorsque tout est fondu, transférer cinq millilitres du milieu dans des flacons stériles de 20 millilitres et un autoclave.Ajouter 200 microlitres de suspension fongique au flacon moyennement stérilisé Tween 80. Pour le contrôle négatif, ajouter cinq millilitres de milieu BH autoclavé dans un flacon de 20 millilitres. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de suspension fongique au flacon.Incuber les flacons à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 21 jours et observez-les tous les sept jours. Le pourcentage de souches fongiques capables de se développer sur la vaseline, l’huile moteur usagée et les poudres plastiques comme seule source de carbone avec différents degrés de succès a été évalué. La capacité des champignons à exploiter la vaseline a été évaluée comme la différence de croissance des colonies entre la BH contrôlée et la vaseline contenant.Près de 75% des souches testées ont pu utiliser la vaseline comme seule source de carbone et 21% ont montré une croissance maximale. La croissance des plaques contenant uniquement du BHA et en présence d’huile moteur a également été surveillée. Près de 90 % des souches se sont développées avec de l’huile moteur usagée, dont 39 % ont affiché une croissance maximale.La formation d’un halo rouge-brunâtre autour de la colonie fongique indiquait une production plus élevée de laccases et d’autres enzymes ligninolytiques. Environ 60% des champignons ont pu produire des laccases. De plus, 17% des souches ont produit un halo sombre intense autour de la colonie dans le milieu guaiacol.L’activité des estérases a été évaluée par la formation d’un précipité blanc chez le milieu Tween 80. Près de 60% des souches ont montré une activité des estérases et 13% ont montré une formation de précipité plus élevée. Ce protocole peut être adapté pour dépister les champignons capables de dégrader tout polluant en ajoutant la substance récalcitrante d’intérêt à un milieu de culture minimal.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Villela, H. D. M. , et al. Prospection de souches microbiennes pour la bioremédiation et le développement de probiotiques pour la recherche et la préservation des métaorganismes. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo montre l’isolement des bactéries marines dégradant les polluants par dilution en série, sélection de colonies et croissance dans un milieu contenant de l’EE2. En utilisant EE2 comme seule source de carbone, le protocole identifie les souches bactériennes capables de métaboliser...

Dépistage des bactéries marines pour l’isolement des souches dégradant les polluants

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Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l&#39;agriculture

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

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Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants

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