Détection de l’accumulation et de la réparation des lacunes post-réplicatives dans les cellules humaines à l’aide du test de fibre d’ADN

Notre protocole ouvre de nouvelles possibilités pour étudier comment la réplication se produit sur l’ADN endommagé. Les techniques peuvent détecter la formation et la réparation de lacunes d’ADN simple brin, en face de la lésion d’ADN. La nucléase S1 clive l’ADN simple brin et permet la détection des lacunes post-réplicatives.

Cette approche a été utilisée pour la première fois par le Dr Meneghini et le Dr Cordiero-Stone dans les années 1970 au Brésil, et récemment adaptée par nous au test des fibres d’ADN. L’utilisation de la technique décrite ici pour étudier la formation et la réparation des lacunes post-réplicatives peut fournir des informations sur le mécanisme de réparation de l’ADN et la réponse au stress de réplication qui maintiennent l’intégrité du génome. Pour les deux protocoles décrits ici, la fibre S1 et les tests de comblement des lacunes, il est crucial d’inclure tous les contrôles pour assurer une interprétation précise des données.

La procédure sera démontrée par Davi J.Martins, un doctorant de notre laboratoire, et le Dr Annabel Quinet, une collaboratrice qui a déjà développé ces techniques lorsqu’il travaillait dans notre groupe. Pour commencer, aspirez le milieu de culture et ajoutez immédiatement le milieu de culture avec 20 micromolaires de milieux d’UDI aux cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant précisément 20 minutes.

Ensuite, lavez rapidement les cellules avec du PBS préchauffé deux fois et irradiez-les avec 20 joules par mètre carré UV-C. Utilisez des cellules non traitées comme témoins. Ajoutez immédiatement le milieu avec du CldU de 200 micromolaires aux cellules et incubez-les à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone pendant 60 minutes précises.

Après cela, lavez les cellules avec du PBS préchauffé deux fois et perméabilisez-les avec le tampon CSK 100 pendant deux à 10 minutes selon la lignée cellulaire à température ambiante. Après la perméabilisation CSK, les noyaux avec presque aucun cytoplasme peuvent être vus par rapport à ceux d’avant la perméabilisation. Versez soigneusement le PBS sur le côté de chaque puits pour laver les noyaux avec du PBS.

Ensuite, lavez les noyaux avec un tampon S1. Incuber les noyaux dans le tampon S1 avec 20 unités par millilitre de nucléase S1, et sans la nucléase S1, pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez le tampon S1 et ajoutez 0,1 % de BSA dans PBS.

Grattez les noyaux et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre approximativement annoté. Gardez les tubes sur la glace tout le temps. Centrifugez les noyaux à environ 4 600 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Remettre en suspension les granulés dans du PBS à une concentration d’environ 1 500 cellules par microlitre. Placez les tubes sur de la glace et procédez immédiatement à la préparation des fibres d’ADN par protocole d’épandage. Annotez les lames du microscope avec un crayon en carbone et placez-les à plat sur un plateau.

Appuyez sur le bas du tube pour assurer l’homogénéisation et ajoutez deux microlitres de cellules sur le dessus de la lame correspondante. Ajouter six microlitres du tampon de lyse et lyser les cellules en pipetant de haut en bas environ cinq fois. Utilisez la pointe de la pipette pour tirer légèrement la goutte vers le bas de la lame et incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour lyser les noyaux.

Inclinez la glissière à environ 20 à 40 degrés et laissez la goutte se propager au bas de la glissière à une vitesse basse constante. Laissez sécher la lame à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, immergez-les dans un bocal contenant la solution de fixation fraîchement préparée et incubez pendant cinq minutes à température ambiante pour fixer l’ADN sur les lames.

Lavez les lames avec du PBS deux fois pendant cinq minutes et dénaturez l’ADN avec de l’acide cloridrique à 2,5 molaires fraîchement préparé pendant 40 à 60 minutes à température ambiante. Lavez les lames avec du PBS trois fois pendant cinq minutes et bloquez avec 5% de BSA préalablement réchauffé pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez doucement sur le papier pour éliminer l’excès de liquide des lames.

Ajouter 30 microlitres d’anticorps primaires aux lames goutte à goutte et placer un couvercle sur le dessus. Incuber pendant 1 à 1,5 heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Placez les lames dans un bocal avec PBS pendant une à deux minutes, puis retirez soigneusement les bordereaux de couverture.

Laver avec PBST dans un bocal trois fois pendant cinq minutes et placer les lames dans PBS. Retirez l’excès de liquide en tapotant doucement sur un papier et ajoutez 30 microlitres d’anticorps secondaires aux lames goutte à goutte. Placez un couvercle sur le dessus.

Incuber pendant 45 à 60 minutes à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Répétez les étapes de lavage des glissières et de retrait de l’excès de PBS une fois de plus et ajoutez 20 microlitres du réactif de montage goutte à goutte aux glissières. Placez un couvercle sur le dessus et évitez les bulles.

Placez une goutte d’huile d’immersion près du haut de la lame où les cellules ont été lysées. Utilisez le canal vert et recherchez les points verts en arrière-plan pour trouver le focus. Ouvrez le logiciel Leica Application Suite, cliquez sur Acquérir et sélectionnez le canal vert.

Ajustez les paramètres du canal vert avant l’analyse. Ensuite, passez au canal rouge et ajustez les paramètres. Trouvez la concentration principale de fibres et déplacez-vous vers les bords pour trouver les fibres individuelles bien étalées, qui ne se chevauchent pas.

Utilisez un seul canal pour sélectionner les régions des images et éviter les biais potentiels. Cliquez sur l’icône Acquérir une superposition et ajustez le logiciel pour le bon grossissement du microscope. Prenez environ 15 à 20 photos par diapositive à côté de la diapositive entière au niveau du canal vert, puis du canal rouge.

Les deux canaux sont maintenant fusionnés et la superposition créée est déplacée vers un dossier unique. Il est possible de voir les fibres avec des couleurs rouges et vertes. Ouvrez le logiciel ImageJ, cliquez avec le bouton gauche sur la cinquième icône, sélectionnez la deuxième option, puis sélectionnez l’outil Ligne segmentée.

Cliquez avec le bouton gauche de la souris pour dessiner le tracé exact du tract rouge ou vert et cliquez avec le bouton droit de la souris pour arrêter le dessin. Appuyez sur le bouton M du clavier pour mesurer la longueur. Pour la fibre S1, gardez une trace des mesures des voies rouges et vertes pour chaque fibre et mesurez les longueurs des voies rouges et vertes à partir d’au moins 150 fibres à partir de différentes images.

Une fibre S1 est montrée dans ces images représentatives. Le tractus d’ADN naissant de contrôle sans les lacunes et imperméable au clivage par la nucléase S1 est montré ici. Le tractus d’ADN positif pour les espaces clivés par la nucléase S1 a entraîné une longueur de tractus CldU plus courte.

Un schéma d’étiquetage différentiel décrit en détail dans le manuscrit de texte peut être effectué pour étiqueter les événements de comblement des lacunes. Dans ce test, appelé test de remplissage d’écart, des pistes d’UDI plus longues avec au moins un patch CldU ou moins de patchs CldU correspondent à une faible densité de remplissage d’écart. Les voies d’UDI plus courtes, avec au moins un patch CldU, et les étendues IDU plus longues avec plus de patchs CldU, correspondent à une densité élevée de remplissage des lacunes.

L’étape de perméabilisation de ce protocole est cruciale pour que la nucléase S1 agisse sur les lacunes formées lors de la réplication de l’ADN endommagé. La nucléase S1 peut également être utilisée dans le protocole de dosage des comètes pour détecter les lacunes formées lors de la réplication de l’ADN endommagé qui persiste après le traitement. Le test de fibres S1 a ouvert la voie au nouveau paradigme selon lequel les lacunes post-réplicatives peuvent provoquer une vulnérabilité au cancer, en particulier dans les cancers du sein et de l’ovaire porteurs de mutations dans les gènes BRCA1 et 2.