Optique non linéaire sans marquage pour l’étude des défauts dépendants de la tubuline dans la myéline centrale

L’imagerie par génération de seconde harmonique d’échantillons biologiques est une technique optique qui permet la visualisation de molécules non centrosymétriques et de leurs assemblages sans avoir besoin d’une étiquette ou d’un colorant. Les images générées avec cette méthode ont un faible fond puisque très peu de molécules biologiques pourraient agir comme une force harmonale. Ce protocole décrit l’application de la technique d’imagerie diagnostique de la tubuline bêta-4A dans le modèle animal taiep.

Les tubulinopathies sont des maladies récemment décrites. Pour cette raison, une quantité limitée d’informations est disponible sur les mécanismes de base sous-jacents à la physiopathologie au niveau cellulaire. Pour commencer, allumez le laser à impulsions pour garantir qu’il sera prêt à se laver à un niveau de puissance optimal et stable.

Pour étudier les microtubules tissulaires, on utilise 10 à 20% de la puissance laser disponible, ce qui correspond dans le système décrit à 13 à 26 milliwatts mesurés au plan focal arrière de l’objectif. Avant l’imagerie, tournez le laser à 810 nanomètres. Assurez-vous ensuite que le microscope est aligné sur l’objectif utilisé pour l’imagerie SHG de deuxième génération harmonique.

Retirez les filtres indésirables du chemin de détection optique et assurez-vous que le diaphragme du condensateur est complètement ouvert et qu’aucune lumière n’est arrêtée inutilement. Préparez un objectif d’immersion dans l’huile à ouverture numérique de 25x x x 0,8 avec une petite goutte d’huile d’immersion dans l’objectif. En suivant les étapes indiquées dans le tableau ici, sauf pour la puissance laser qui est inférieure à 5% pour la fécule de maïs.

Image fécule de maïs sèche prise en sandwich entre des lames de verre. avec des paramètres SHG pour générer des images SHG, ils révèlent la direction de polarisation du laser. Capturez une image de grains de fécule de maïs clairsemés et marquez l’orientation des lobules SHG dans le plan XY correspondant à l’orientation de polarisation laser.

Pour le contrôle, prenez une autre image du même échantillon insérant une plaque demi-onde dans le chemin optique pour modifier la direction d’oscillation du laser. L’image résultante affiche des lobules de signal SHG tournés. Si vous utilisez un filtre passe-bande différent pour le SHG, assurez-vous qu’il possède des propriétés de transmission optimales en comparant les images et les intensités du signal pixel par pixel le long de la ligne de balayage.

Préparez un plateau tampon vibratome rempli d’une solution chaude de sel équilibré de Hanks ou HBSS. Fixez le cerveau à la plaque d’échantillon à l’aide de colle cyanoacrylate via un morceau de ruban de masquage. La partie la plus caudale entre en contact avec la colle afin que les sections coronales utilisables de la partie rostrale opposée puissent être coupées.

Transférer la plaque d’échantillon sur son support magnétique à l’intérieur du plateau tampon. Commencez à couper des sections de 300 à 500 microns jusqu’à ce que les tranches englobent toute la surface du cerveau. Réduisez ensuite l’épaisseur de la section à 160 microns.

Une fois qu’une section de 160 microns est découpée au niveau du corps calleux, récupérez-la avec une pipette Pasteur en verre modifiée avec un grand orifice à bride. Transférer la section dans une boîte de Petri propre avec un nouveau HBSS chaud ou directement sur le couvercle ou la boîte à fond en verre pour la microscopie. Placez l’échantillon sous le microscope et positionnez-le de manière appropriée sous l’objectif par observation directe à travers les oculaires avec lumière transmise.

Retirez l’excès HBSS de sorte qu’un film liquide mince recouvre tout l’échantillon. Vérifiez visuellement le film liquide toutes les quelques minutes pour éviter une évaporation et un séchage excessifs de l’échantillon. Préparez l’étape du microscope pour l’imagerie non numérisée, ce qui comprend la fermeture de toutes les portes de la chambre d’incubation sombre ou le recouvrement de la chambre d’incubation avec un tissu enduit de polyuréthane en nylon noir.

Sélectionnez le mode d’imagerie non numérisé le long du chemin de transmission. De cette façon, la capture du faible signal SH de la tubuline sera optimisée. Sélectionnez ensuite l’objectif.

Ensuite, définissez une puissance laser avec un temps de séjour en pixels de 12,6 microsecondes. Prenez des images ne dépassant pas 512 x 512 pixels avec une vitesse de cinq et une moyenne de deux pour un temps d’acquisition moyen de 15 secondes. Capturez d’abord des images à l’aide d’un filtre passe-court de 485 nanomètres, puis ajoutez un filtre passe-bande de 405 nanomètres.

Coupez le cervelet avec un scalpel en deux hémisphères et fixez-les au support du vibratome par la partie centrale. Coupez et imagez le cervelet en utilisant les mêmes réglages de vibratome, de lame et de microscope que ceux décrits pour le cerveau. Lorsque les fibres du corps calleux sont imagées, des structures courtes ressemblant à des fibres et des éléments arrondis sont observés dans le cerveau taiep.

En revanche, le corps calleux du cerveau témoin montre un signal beaucoup plus hétérogène et isotrope dans toute la région du cerveau. L’origine du signal différentiel réside spécifiquement dans le phénomène de génération de seconde harmonique puisque l’ajout du filtre passe-bande étroit ne diminue que l’intensité du signal non spécifique des images de contrôle, tout en supprimant sélectivement ce signal diffus faible autour du soma-like et les structures allongées courtes dans les images taiep qui génèrent toujours une lumière SH intense. Dans le tissu témoin de la substance blanche cérébelleuse, l’absence totale de signal SH a été observée.

Les cellules de Purkinje sont à peine visibles lors de l’utilisation du filtre passe-court, et les structures allongées et arrondies persistent dans l’image SH du tissu taiep. Une étape critique pour obtenir la meilleure image est de couper les sections de tissu aussi fines que possible. De plus, travailler avec des coupes tissulaires aiguës nécessite des protocoles rapides pour prévenir la détérioration des tissus.

Par conséquent, il est crucial de configurer et de vérifier le système optique au préalable. Le signal de seconde harmonique des microtubules est plus faible que le signal de seconde harmonique de l’amidon. Par conséquent, plus de puissance laser doit être utilisée pour l’imagerie des microtubules.

La puissance du laser doit être augmentée avec précaution car, comme un objectif à grande ouverture numérique est utilisé pour l’imagerie, l’intensité à l’échantillon augmenterait rapidement Avec l’imagerie de deuxième génération harmonique, les changements pathologiques dans le myélinomatique central du modèle tubulinopathique sont rapidement et facilement identifiés. Les applications potentielles de cette technique comprennent son utilisation pour l’étude des mécanismes de base de la tubulopathie H-ABC et pour l’évaluation des thérapies pharmacologiques pour traiter les patients. À long terme, la technique a le potentiel de devenir un outil de diagnostic complémentaire à utiliser par voie intracrânienne ou sur des biopsies fraîches.