Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride
9 mars 2022
Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho0 ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.
La cybergénération est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADN mitochondrial et pour corréler le pourcentage d’atriplasmie avec la gravité de la maladie. Cette technique permet d’effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène, dans lequel la contribution du fond nucléaire du patient est absente. Cette technique permet de valider la pathogénicité d’une mutation de l’ADN mitochondrial.
et permet d’étudier son impact au niveau biochimique Laver les plats de 35 millimètres contenant les fibroblastes deux fois en utilisant deux millilitres de 1X PBS sans calcium ni magnésium. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle avec 70% d’éthanol et attendez que l’alcool s’évapore. Retirez les couvercles de la vaisselle et les bouchons à vis des bouteilles.
Placez chaque plat sans le couvercle à l’envers au fond de chaque bouteille de centrifugeuse de 250 millilitres. Ajouter lentement 32 millilitres d’un milieu de nucléation à chaque bouteille permettant au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. Retirez toutes les bulles de la vaisselle à l’aide d’une longue pipette de pâturage en verre, en courbant la pointe dans une flamme de bunsen.
Fermez chaque bouteille avec le bouchon à vis et transférez-les à la centrifugeuse. Centrifuger pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 8 000 x G.Aspirer le milieu des bouteilles et le jeter. Retirez la vaisselle en inversant les bouteilles sur une gaze stérile préalablement pulvérisée avec de l’éthanol à 70%.
Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle et de leurs couvercles avec de l’éthanol à 70% et fermez la vaisselle après l’évaporation de l’éthanol. Avant de procéder, vérifiez la formation de cytoplastes à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes. Recherchez des fibroblastes extrêmement allongés en raison de l’extrusion de leurs noyaux induite par la cytochalasine.
À chaque plat de 35 millimètres, ajoutez 1 000, 143 cellules de rangée zéro. Remis en suspension dans deux millilitres de milieu de culture complété par 5% FBS. Laissez la vaisselle pendant trois heures dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié pour déposer les 143 cellules de la rangée zéro sur les fantômes.
Après trois heures d’incubation, aspirer et jeter le milieu. Lavez les cellules d’adhérence deux fois avec deux millilitres de milieu de glucose élevé DMEM sans sérum ni MEM, puis aspirez et jetez le milieu. Ajouter 500 microlitres de solution de polyéthylène glycol aux cellules et incuber pendant exactement une minute.
Aspirer et jeter la solution de polyéthylène glycol. Lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de DMEM à haute glycémie sans sérum ou avec MEM. Ajouter deux millilitres de milieu de fusion et incuber pendant la nuit dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Trypsiniser les cellules dans les boîtes de culture restantes Les compter et les ensemencer dans une ou plusieurs boîtes de Pétri Ajouter 50 à 100 cellules par plat dans la culture supplémentée jusqu’à l’apparition de clones. Ensuite, laissez-les pousser pendant plusieurs jours. À l’aide d’un stéréomicroscope, ramassez les clones de la boîte de Pétri avec des cylindres de clonage ou une pointe de pipette.
Essayez d’éviter de mettre en commun différents clones et transférez-les sur une plaque de 96 puits, chaque puits contenant 200 microlitres de milieu de culture supplémenté. Les cybrides ont été générées à partir de fibroblastes dérivés d’un patient porteur de l’hétéroplasmique M2343A2G L’une des mutations les plus courantes de l’ADN mitochondrial associées à la myopathie mitochondriale, à l’acidose lactique encéphalopathie et aux épisodes de type accident vasculaire cérébral. L’analyse d’un nombre variable de répétitions en tandem a montré que le cyber-ADN est identique aux cellules de la rangée zéro confirmant le remplacement du cyber-ADN du patient par le génome 143 B.
Le polymorphisme de longueur de fragment de restriction, ou analyses de séquençage, peut être utilisé pour évaluer la présence de la mutation de l’ADN mitochondrial et le pourcentage d’hétéroplasmie. Lors de la tentative de ce protocole, il est important de vérifier l’actif génétique correct du nucléon et de l’ADN mitochondrial, ainsi que la quantité d’ADN mitochondrial dans les cybrides repeuplés.
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Aperçu
Les cybrides transmitochondriaux sont des cellules hybrides créées par la fusion de cellules appauvries en ADN mitochondrial avec des cytoplastes provenant de patients atteints de troubles mitochondriaux. Cette approche permet de déterminer l'origine des maladies et d'évaluer les activités biochimiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Génétique mitochondriale
Contexte
- Les cybrides trans-mitochondriaux sont essentiels à l'étude des troubles mitochondriaux.
- Ils permettent d'analyser les contributions nucléaire et mitochondriale à la maladie.
- Cette technique est cruciale pour valider la pathogénicité des mutations de l'ADNmt.
- Comprendre l'impact biochimique des mutations est vital pour la prise en charge de la maladie.
Objectif de l'étude
- Étudier le rôle pathogène de nouvelles mutations de l'ADN mitochondrial.
- Corréler le pourcentage d'hétéroplasmie avec la gravité de la maladie.
- Réaliser des investigations biochimiques dans un environnement nucléaire contrôlé.
Méthodes utilisées
- Fusion de cellules rho 0 avec des cytoplastes énucléés.
- Essais biochimiques pour évaluer la fonction mitochondriale.
- Validation des mutations de l'ADNmt par analyse de cybrides.
- Utilisation de PBS et d'éthanol pour la préparation des cellules.
Résultats principaux
- Création réussie de cybrides transmettant des mitochondries.
- Identification d'activités biochimiques associées aux mutations de l'ADN mitochondrial.
- Corrélation établie entre les niveaux d'hétéroplasmie et les résultats cliniques de la maladie.
- Confirmation du rôle pathogène de variants spécifiques de l'ADN mitochondrial.
Conclusions
- Les cybrides transmitochondriaux sont efficaces pour l'étude des maladies mitochondriales.
- Cette méthode améliore la compréhension des mutations de l'ADNmt et de leurs effets.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur ces découvertes pour développer des thérapies ciblées.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les modèles cybrides trans-mitochondriaux permettent une analyse précise des contributions respectives du génome mitochondrial et du génome nucléaire au dysfonctionnement de la chaîne respiratoire (OXPHOS), un point critique dans la recherche sur les maladies mitochondriales. Cette approche fournit une détection mécanistique des risques et une validation ciblée des mutations de l’ADN mitochondrial, renforçant la fiabilité prédictive en recherche exploratoire et translationnelle précoce. La capacité du système cybride à isoler et à caractériser la pathogénicité fonde les décisions de portefeuille ajustées au risque pour les programmes sur les troubles mitochondriaux.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe de la pathogénicité des mutations de l'ADN mitochondrial dans un contexte nucléaire contrôlé.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en distinguant les défauts de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) induits par l'ADNmt de ceux induits par l'ADNn.
- Facilite la caractérisation mécanistique et la réduction des risques associés aux nouvelles variantes mitochondriales avant tout investissement ultérieur.
- Offre une plateforme pour corréler les niveaux d'hétéroplasmie avec des phénotypes pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Établit des lignées cybrides validées pour des essais biochimiques et génétiques reproductibles.
- Permet la mesure quantitative de l'activité de la phosphorylation oxydative et de l'impact des mutations.
- Facilite la normalisation des essais et la reproductibilité interlaboratoires en recherche mitochondriale.
- Prépare des systèmes cellulaires robustes pour le criblage de composés ciblant le dysfonctionnement mitochondrial.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles cybrides pertinents pour la maladie avec le développement translationnel de biomarqueurs.
- Assure une continuité allant de la découverte génétique à la validation préclinique des cibles mitochondriales.
- Permet une progression ajustée au risque des interventions candidates fondée sur des preuves mécanistiques.
- Prend en charge la détection prédictive des risques pour les portefeuilles de maladies mitochondriales.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le modèle cybride s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant la vérification d'hypothèses, la validation de cibles et l'élucidation mécanistique des troubles mitochondriaux.
- Biologie de la découverte : Soutient le test d'hypothèse nulle concernant la pathogénicité des mutations de l'ADNmt et précise les facteurs génétiques responsables du dysfonctionnement de la chaîne respiratoire.
- Dépistage : Fournit des lignées cybrides standardisées et reproductibles pour des dosages biochimiques quantitatifs.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de l'hétéroplasmie et de l'activité de la chaîne respiratoire destinées à des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes génétiques et la validation de modèles précliniques ainsi que l'harmonisation des biomarqueurs.
- Réutilisation institutionnelle : Offre une plateforme réutilisable pour la découverte continue de cibles mitochondriales et de biomarqueurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur les maladies mitochondriales.
- Valeur opérationnelle : Normalise la génération et la caractérisation des cybrides afin d'assurer la reproductibilité et l'extensibilité.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et une gestion efficace du portefeuille en termes de capitaux.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et la progression des programmes sur les troubles mitochondriaux ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en fusion cellulaire, en génétique mitochondriale et en développement de tests biochimiques.
- Exige un accès à des infrastructures spécialisées pour la culture cellulaire, la centrifugation et l'analyse moléculaire.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes des protocoles de génération et de validation des cybrides.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types cellulaires ou les contextes génétiques liés à des maladies.
- La vérification des constituants génétiques nucléaires et mitochondriaux est essentielle pour la fidélité du modèle.
