Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

En utilisant cette méthode de cytométrie en flux de quantité, les chercheurs peuvent calculer les coutumes cinétiques et d’équilibre de l’interaction membranaire apportée et estimer le nombre de protéines apportées par les sites sur la membrane PPH. Les avantages de cette méthode sont la simplicité et la disponibilité des réactifs et des équipements. Cette méthode est exclusivement destinée à la recherche fondamentale.

Le protocole a été développé pour étudier les interactions des lipides protéiques dans le calcul du sang et peut être utilisé dans d’autres domaines pour caractériser l’interaction des protéines avec diverses membranes lipidiques. La méthode peut être utilisée pour l’évaluation quantitative de la dynamique de liaison des ligands sur les différentes cellules et types de ligands. Commencez les expériences de liaison cinétique en diluant les vésicules de phospholipides dans le tampon de Tyrode à une concentration d’un micromolaire et un volume total de 250 microlitres.

Ensuite, mélangez le facteur de coagulation X ou FX FD marqué par fluorescence et une concentration de 500 nanomolaires avec les vésicules phospholipides dans un rapport de un à un pour obtenir un volume total de 500 microlitres. Injecter immédiatement 500 microlitres de la suspension mélangée dans le cytomètre en flux. À un débit avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et un filtre d’émission de 585 nanomètres; avec une largeur de 42 pour le canal FL deux.

Ensuite, mesurez la fluorescence moyenne dans le canal FL quatre avec une excitation à 633 nanomètres et un filtre d’émission à 660 nanomètres avec une largeur de 20. Lorsque la saturation de liaison est atteinte, diluez rapidement l’échantillon 20 fois avec le tampon de Tyrode et surveillez la dissociation jusqu’à ce qu’une fluorescence de base, ou un plateau, soit atteinte. Pour les expériences de liaison à l’équilibre, incubez cinq vésicules phospholipides artificielles micromolaires avec des concentrations variables de FX FD de zéro à 1000 nanomolaires dans le tampon de Tyrode pendant 20 minutes.

Après l’incubation, diluer chaque échantillon de 20 fois pour obtenir un volume final de 200 microlitres avec le tampon de Tyrode, puis analyser l’échantillon dilué par cytométrie en flux dans les 30 secondes. Pour analyser les données, exportez les expériences au format FSC du logiciel d’acquisition de données de cytométrie vers le logiciel de cytomètre pour l’analyse des données. En choisissant le fichier, puis en cliquant sur les onglets Exporter et Fichiers FSC.

Une fois cela fait, ouvrez les fichiers FCS dans le logiciel cytométrique en sélectionnant les fichiers sur l’ordinateur et en les faisant glisser vers l’espace de travail du programme. Pour le contrôle des microvésicules, identifier la région des microvésicules par fluorescence du colorant lipophile, DIC 16 trois. Utilisez ensuite le bouton de tracé dans la feuille de calcul pour créer un diagramme à points SSC à partir de FL deux D I C 16 dans les coordonnées du journal.

Choisissez ensuite le bouton de porte rectangulaire pour dessiner une zone de grille. Pour analyser les expériences cinétiques, créez un diagramme de points en utilisant les coordonnées de fluorescence au fil du temps pour la région des vésicules. Ensuite, exportez les données sur le changement de fluorescence au fil du temps au format CSV; en choisissant l’échantillon et en cliquant avec le bouton droit sur l’onglet d’exportation, puis en choisissant FL quatre fois dans les paramètres, sélectionnez le répertoire à enregistrer avant de cliquer sur le format CSV sélectionné et d’appuyer sur l’onglet d’exportation.

Après le transfert, ouvrez le fichier CSV dans un logiciel statistique pour calculer la fluorescence et le temps de la moyenne mobile simple pour chaque 1000 événements approximatifs d’un graphique de la dépendance de la fluorescence de moyenne mobile unique sur le temps sous l’hypothèse de la dépendance exponentielle et utilisez la valeur pour calculer la constante d’association cinétique à l’aide d’une équation. Calculez ensuite la constante de dissociation cinétique à l’aide de l’équation décrite précédemment. Pour analyser la date du test de liaison à l’équilibre, déterminer la fluorescence moyenne de FX FD dans la région des vésicules pour chaque concentration sélectionnée de FX FD, puis approximer la dépendance de la fluorescence du facteur lié de la concentration du facteur ajouté dans l’hypothèse de liaison à site unique.

Calculez les paramètres de liaison moyens à l’aide d’une équation à partir de trois répétitions indépendantes au minimum. Procéder à la préparation des billes calibrées en incubant des plaquettes filtrées en gel avec du calcium IANA 4A vingt-trois, cent quatre-vingt-sept en présence de chlorure de calcium de 2,5 millimolaires pendant 10 minutes à température ambiante. Les plaquettes activées ajoutent-elles les différentes concentrations de FX FD et incubent-elles les plaquettes avec du formaldéhyde à deux pour cent de volume.

Après une heure, arrêtez la réaction en incubant les plaquettes avec trois glycine molaires et 5% de BSA pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, purifiez le mélange du colorant non réagi avec une centrifugation à 400 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnate avant de le réutiliser dans le tampon de Tyrode contenant 0,5% de BSA.

Ensuite, mesurez le niveau de fluorescence des billes d’étalonnage dans chaque échantillon à l’aide d’un spectrofluoromètre, puis à l’aide du cytomètre en flux. Déterminez le nombre de perles dans chaque échantillon à l’aide d’un compteur de cellules. Convertissez l’intensité de fluorescence de chaque échantillon de billes respectif en concentration de colorant fluorescent soluble à l’aide d’un spectrofluoromètre et recalculez la concentration de colorant fluorescent pour le nombre de molécules de spectrofluoromètre.

Créer un graphique de dépendance de la fluorescence moyenne des billes dans un cytomètre en flux sur le nombre de molécules de flurophore pour chaque échantillon. Ensuite, approximez la dépendance par proportionnalité de ligne à l’aide de l’ajustement d’analyse et ajustez les onglets linéaires dans l’ordre. À partir de l’approximation dans l’équation, calculez le facteur de conversion de la fluorescence moyenne en sites de liaison.

Calculez plus tard le nombre apparent de sites de liaison par vésicule d’intérêt. L’analyse représentative montre la fermeture des vésicules lipidiques artificielles au phosphore d’une taille d’un micromètre avec le colorant fluorescent lipophile incorporé, le colorant I C 16, la porte a été fixée sur la base d’un échantillon contenant des vésicules lipidiques artificielles de même taille sans le colorant fluorescent. La cinétique de la protéine se liant aux vésicules a été analysée au premier stade en collectant l’échantillon en continu.

Les données obtenues ont été analysées par cytométrie en flux. Les mesures cytométriques en flux doivent commencer dès que possible après le mélange des solutions et la dilution avec le tampon de Tyrode. La méthode proposée pourrait être complétée par une résonance plasmatique de surface pour étudier les interactions membranaires qui sont très sensibles avec une bonne résolution temporaire et ne nécessitent pas de livraison Le principal avantage de cette méthode est son accessibilité et sa simplicité.